于建寧，閆樂艷，陳 哲，邵西兵，戴子淳，應(yīng)詩家，施振旦

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室，江蘇 南京 210014)

鵝原始生殖細胞體外分離與冷凍保存方法的比較研究

于建寧，閆樂艷，陳 哲，邵西兵，戴子淳，應(yīng)詩家，施振旦*

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室，江蘇 南京 210014)

為了建立針對鵝原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)的分離純化與冷凍保存方法，對血液Ficoll密度梯度離心法、血液ACK裂解法、生殖腺胰酶-EDTA消化法與生殖腺消化結(jié)合體外短時間培養(yǎng)法4種PGCs分離方法以及STEM-CELLBANKER、CELLBANKER 2與10%DMSO加90%血清等3種凍存液進行了比較研究。通過形態(tài)學觀察、糖原染色與PGCs特異免疫熒光染色鑒定PGCs，同時利用臺盼藍染色檢測PGCs活力等方法對其分離和保存效果進行評價。結(jié)果表明，從鵝胚血液與生殖腺中均已經(jīng)成功分離到鵝PGCs；生殖腺消化結(jié)合體外短期培養(yǎng)法與傳統(tǒng)的血液分離法相比，獲得的鵝PGCs數(shù)量、純度與活力最高，每枚胚胎獲得的鵝PGCs數(shù)量達到115個、細胞純度達80.8%、細胞活率達88.3%；而商業(yè)化的干細胞冷凍保護液STEM-CELLBANKER同一般的體細胞凍存液相比更適合鵝PGCs的冷凍保存，冷凍解凍后的細胞存活率達90%左右。試驗可以得出結(jié)論：生殖腺消化結(jié)合體外短期培養(yǎng)法成功分離到數(shù)量與純度都可觀的鵝PGCs，STEM-CELLBANKER凍存液能夠用于鵝PGCs的長期冷凍保存。

鵝；原始生殖細胞；生殖腺消化結(jié)合短期培養(yǎng)法；冷凍保存

目前畜禽種質(zhì)資源保存采用的主要方式是活體動物保種，即建立規(guī)模較大的保種資源場，集中保存遺傳資源。但對活體保種而言，保護群的有效群體含量與保種有效程度始終是一對矛盾。不僅如此，由此帶來近親繁殖、物種衰退及疾病威脅等問題[1]，所以探索新的畜禽遺傳資源保護方法和技術(shù)，實現(xiàn)高效保種是我們所面臨和必須解決的難題。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，非活體保種技術(shù)將有效解決活體保種的不足，成為活體保種的有效補充甚至替代[2]。在哺乳動物中非活體保種技術(shù)比較成熟，如精子與卵子的冷凍保存技術(shù)及胚胎冷凍保存技術(shù)。但對于禽類，因卵個體大且卵黃多無法采用配子或胚胎冷凍保存技術(shù)，因此建立禽類的非活體保種技術(shù)尤為重要。

原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)是配子前體細胞，與配子相比攜帶的遺傳信息更全面，而且目前基于冷凍保存PGCs的非活體保種技術(shù)在雞上已初顯成效。通過冷凍保存的PGCs實現(xiàn)新個體的再生，是利用PGCs制備種系嵌合體、使供體PGCs分化成功能性配子、最后通過橫交獲得純合的PGCs供體后代。這一技術(shù)包括PGCs的體外分離純化與冷凍保存技術(shù)、種系嵌合體制備技術(shù)及橫交獲得純合體后代，這些技術(shù)是一個整體，相輔相成，缺一不可。通過這套技術(shù)，人們已經(jīng)獲得了來自冷凍保存后的雞PGCs的純合子后代[3-4]，可見實現(xiàn)禽類非活體保種在技術(shù)上是完全可行的。

迄今，這一技術(shù)主要用于雞與野生鳥類的保種研究以及禽類的轉(zhuǎn)基因或生長發(fā)育機制方面的基礎(chǔ)研究，尚未見在水禽上(鴨、鵝)以保種應(yīng)用研究為目標的研究，故有必要對鵝PGCs的體外分離、純化與冷凍保存進行針對性的研究。本試驗在雞PGCs體外分離純化方法[5]的基礎(chǔ)上，根據(jù)鵝不同發(fā)育時期，采用不同的PGCs分離方法并加以優(yōu)化創(chuàng)新，總結(jié)出其中效率最高的方法。同時采用實驗室較為常用的細胞凍存液冷凍保存PGCs，比較PGCs冷凍保存后的存活能力，為后期利用冷凍保存的PGCs獲得生殖嵌合體奠定可行性基礎(chǔ)，最終達到利用PGCs進行鵝非活體種質(zhì)資源保存的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

鵝種蛋購于常州陽湖鵝業(yè)專業(yè)合作社，品種為揚州白鵝。

PBS、DMEM培養(yǎng)液、TCM199均購自Invitrogen公司，F(xiàn)icoll 400、多聚甲醛、BSA、Triton X-100、Hoechst 33342購于Sigma公司，定性濾紙購于GE公司，微針購于Origio公司，一抗兔多克隆抗體anti-DDX4(MVH antibody)、二抗Cy3標記的山羊抗兔IgG均購于Abcam公司，其余普通化學試劑均為國產(chǎn)、進口分裝或進口。培養(yǎng)基、試劑的配制若無特別要求，均以重蒸水為溶劑，高壓滅菌條件為102.9 kPa蒸氣滅菌30 min。

Ficoll 400的配制：將0.63 g Ficoll 400溶于含有10 mL 10% FCS(V/V)的TCM 199中，即配成6.3%(m/V)的Ficoll 400；將1.60 g Ficoll 400溶于10 mL含有10% FCS(V/V)的TCM 199中，即配成16%(m/V)的Ficoll 400。

培養(yǎng)PGCs的KnockOut DMEM的配制：40% BRL條件化KnockOut DMEM，7.5% FCS，2.5% 雞血清，2 mmol·L-1GlutaMax，1×非必需氨基酸，1 mmol·L-1丙酮酸鈉，0.1 mmol·L-1β-巰基乙醇，1%青鏈霉素，6 ng·mL-1合成小鼠SCF，4 ng·mL-1合成人FGF。抽濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

濾紙環(huán)制作：用打孔器將濾紙做成內(nèi)徑為1.8 cm、外徑為2.6 cm的環(huán)形濾紙片，用于鵝胚從蛋內(nèi)轉(zhuǎn)移到平皿中。

1.2 鵝血液中原始生殖細胞的分離純化

Ficoll密度梯度離心法：由于雞血液中分離PGCs的發(fā)育時期為14～16期(48～60 h)[6]，與之相對應(yīng)，鵝胚需要發(fā)育至3.5～4.0 d。鈍端開口，暴露胚胎，濾紙環(huán)將胚胎轉(zhuǎn)移至PBS液中輕輕清洗，放置于平皿中，于實體顯微鏡下使用微針在兩側(cè)卵黃靜脈中吸取血液，最后放入盛有10% FCS的TCM199離心管中備用。將收集于離心管中的血液1 000g、離心5 min棄上清，細胞沉淀中加入0.1 mL不含F(xiàn)CS的TCM 199，再加入0.9 mL 16% Ficoll，充分混勻后，在其上緩緩覆蓋0.2 mL 6.3%的Ficoll，800g水平離心30 min。富含PGCs的部分位于6.3%與16% Ficoll界面處，移液器緩緩移走位于離心管表面的100 μL液體后，再緩慢吸取200 μL，溶解于300 μL的TCM199中，250g離心，再溶于300 μL的TCM199中，如此反復重復3次，倒置顯微鏡下觀察計數(shù)。

ACK裂解法：與Ficoll密度梯度離心法收集血液方法相同，將采集的血液置于100 μL 3.8%(m/V)檸檬酸鈉緩沖液中。將900 μL ACK裂解液加入到100 μL血液樣品中，輕輕吹打均勻后置于冰上30 min。4 ℃、450g離心10 min，收集沉淀重新溶于ACK裂解液，置于冰上15 min后，以450g離心10 min。收集細胞沉淀于PBS中漂洗兩次，得到初步純化的PGC懸液，倒置顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.3 鵝生殖腺中原始生殖細胞的分離純化

雞生殖腺中PGCs的分離采用發(fā)育至28～30期(6～7 d)的胚胎[7]，依據(jù)生產(chǎn)中鵝胚與雞胚發(fā)育的時間對應(yīng)，同時根據(jù)解剖后鵝胚生殖腺的形態(tài)特點與分離出的PGCs數(shù)量多少，最終確定采用發(fā)育至8～9 d的鵝胚。

將胚胎從種蛋中取出，生殖腺位于腎上方，呈條狀，仔細剝離其他組織，在PBS中清洗3次，即獲得左右兩條生殖腺。用不含鈣鎂的PBS將0.25%胰蛋白酶-EDTA稀釋3倍，左右兩條生殖腺放在已經(jīng)稀釋好的胰蛋白酶-EDTA中37 ℃消化5 min，用200 μL的移液器輕輕吹打約50 次，直至沒有明顯細胞團塊，DMEM終止消化，250g離心5 min。將離心獲得的細胞沉淀中加入400 μL KnockOut DMEM，于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3～4 h 后可見除原始生殖細胞外的多數(shù)細胞貼壁，輕輕吹打培養(yǎng)液，將未貼壁細胞連同培養(yǎng)液一起移入離心管中，250g離心收集細胞，即獲得鵝生殖腺原始生殖細胞。

1.4 鵝原始生殖細胞的鑒定

1.4.1 糖原染色(PAS)

糖原染液試劑盒購于南京建成科技有限公司，根據(jù)試劑盒說明進行操作。將細胞懸液涂片晾干，4%多聚甲醛固定3～5 min；在0.5%高碘酸溶液中10～12 min，蒸餾水沖洗5 min 2次；傾去載玻片上的液體，放入Schiff試劑中避光10 min；迅速用蒸餾水沖洗后，亞硫酸氫鈉溶液沖洗5 min 2次；自來水沖洗5 min，用蒸餾水沖洗5 min；滴一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.4.2 原始生殖細胞的免疫熒光染色

試劑：一抗是兔多克隆抗體anti-DDX4(MVH antibody)、二抗是Cy3標記的山羊抗兔IgG、不含鈣鎂的PBS、多聚甲醛、BSA、Triton X-100、Hoechst 33342。

染色步驟：4%多聚甲醛固定PGCs，4 ℃過夜；放于黏附載玻片(表面帶正電荷)上，自然風干；PBS-T清洗3次，每次30 min；含有1%BSA的PBS液處理6 h，以阻斷非特異性蛋白；0.1% Triton X-100處理10～20 min；PBS-T清洗后，anti-DDX4 一抗1∶100稀釋，4 ℃孵育過夜；PBS-T清洗后，二抗1∶1 000稀釋，37 ℃避光孵育1 h；將Hoechst 33342 用PBS稀釋1 000倍至10 μg·mL-1，加入到PGCs中，避光染色2 min；倒置熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.5 鵝原始生殖細胞的臺盼藍染色

細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9∶1混合混勻。在3 min內(nèi)，分別計數(shù)活細胞和死細胞。鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。

統(tǒng)計細胞活力：活細胞率=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%。

1.6 鵝原始生殖細胞的冷凍保存

采用日本ZENOAQ公司生產(chǎn)的干細細專用凍存液(STEM-CELLBANKER)、CELLBANKER 2 與自行配制的10%DMSO加90%血清，冷凍程序為將原始生殖細胞收集于試管中，加入適量的細胞凍存液于離心管中，使細胞濃度為5×105至5×106cells·mL-1，緩慢地混合均勻，制成細胞混合液，將離心管中的細胞混合液分裝于已標示完全的冷凍保存管中，直接將含細胞混合液的凍存管放入-80 ℃冰箱(至少24 h)，移至-196 ℃液氮罐長久保存。

解凍程序為從液氮罐中取出細胞冷凍保存管，立即放入37 ℃振動水浴槽中快速解凍，待凍存管中細胞混合液完全融化后，立即加入1 mL KnockOut DMEM培養(yǎng)基于該冷凍管中與細胞混合，再將細胞混合液從凍存管中移入含有9 mL該細胞培養(yǎng)基的試管中，混合均勻，離心收集培養(yǎng)細胞，移去上清液，進行臺盼藍染色，統(tǒng)計細胞存活率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個處理重復3次，所得數(shù)據(jù)采用 SPSS 11.0 中ANOVA進行相關(guān)統(tǒng)計學分析，顯著性差異以P<0.05為標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝原始生殖細胞的鑒定

2.1.1 糖原染色法鑒定

從鵝胚血液和生殖腺中分離的PGCs經(jīng)糖原染色結(jié)果如圖1所示，深紫色的為PGCs，而其他細胞呈淡藍色，形成明顯的著色差異?？梢妰煞N分離方法均成功分離到PGCs。

2.1.2 免疫熒光染色法鑒定

為進一步確定分離的細胞中存在一定比例的PGCs，在糖原染色的基礎(chǔ)上，采用目前公認鑒定PGCs的最有效方法——免疫熒光染色。利用PGCs特異表達Vasa蛋白，將抗Vasa的多克隆抗體anti-DDX4(一抗)處理分離的細胞，再用Cy3標記的二抗(紅色熒光)處理后于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖2所示，PGCs細胞除細胞核為藍色外，細胞膜周圍呈紅色熒光；而其他類型的細胞只有細胞核為藍色，細胞膜周圍無紅色熒光。由此可見，分離出的細胞中存在一定比例的PGCs。

2.2 鵝原始生殖細胞不同分離方法的效果比較

采用4種方法分離純化鵝原始生殖細胞，分別為血液Ficoll密度梯度離心法、血液ACK裂解法、生殖腺胰酶-EDTA消化法與生殖腺消化結(jié)合體外短時間培養(yǎng)法。從每個胚胎分離的PGCs數(shù)量、PGCs的純度和PGCs的成活率三個方面對以上4種分離純化方法進行評價。從表1中可以看出，血液中分離的PGCs數(shù)量顯著低于生殖腺中分離的PGCs數(shù)量(P<0.05)；從分離后PGCs的純度看，生殖腺消化法結(jié)合體外培養(yǎng)4 h后PGCs的純度能達到80%以上，血液密度梯度離心的純度為64.4%，ACK純化法為46.7%，而生殖腺消化后的純度僅為11.8%，4種分離方法間差異顯著(P<0.05)；4種分離方法的PGCs成活率均比較高，其中血液密度梯度離心法、生殖腺消化法和生殖腺消化結(jié)合體外培養(yǎng)法的成活率都接近90%，ACK裂解法較低，為77.7%。

A，鵝胚血液中分離的PGCs；B，鵝胚生殖腺中分離的PGCs；箭頭所示為陽性著色的PGCsA， PGCs isolated from goose blood; B， PGCs isolated from goose gonads. The arrows indicate the positive PGCs圖1 糖原染色后的鵝原始生殖細胞Fig.1 The goose PGCs stained by PAS

A，明場下PGCs；B，特異免疫熒光染色后PGCs呈紅色熒光；C，Hoechst 33342染色后PGCs呈藍色熒光；D，B與C的疊加圖A， PGCs in light; B， PGCs show red fluorescence after specific immunofluorescence staining; C， PGCs show blue fluorescence after Hoechst 33342 staining; D， The merge image between B and C圖2 PGCs特異抗體染色Fig.2 The specific antibody staining of PGCs

表1 鵝胚PGCs不同分離純化方法的效果比較

Table 1 Comparison of the isolation effects of four different methods of PGCs collection from goose embryos

分離方法Methodsforisolation胚胎數(shù)量Numberofembryos每個胚胎分離的PGCs數(shù)NumberofPGCsperembryo分離后PGCs的純度PercentagepurityofPGCsafterisolation/%PGCs的活率RateofviablePGCs/%血液密度梯度離心法Blooddensitygradientcentrifugation12054.0±3.1b64.4±3.3b88.0±1.5a血液ACK裂解法BloodACKlysis12653.3±1.8b46.7±0.9c77.7±1.5b生殖腺消化法Gonadsdigestion108115.7±2.2a11.8±0.7d90.0±1.0a生殖腺消化法+體外培養(yǎng)Gonadsdigestion+cultureinvitro105115.0±2.5a80.8±1.2a88.3±0.5a

同一列中沒有相同小寫字母表示處理組之間差異顯著(P<0.05)。

The values with different small letters in the same column mean significant differences between the treatments (P<0.05).

2.3 鵝原始生殖細胞的冷凍解凍效率測定

分別將血液中和生殖腺中分離純化的PGCs在液氮中冷凍保存1個月，冷凍液分別為STEM-CELLBANKER、CELLBANKER 2與10%DMSO加90%血清。解凍后臺盼藍染色，著藍色的為死亡PGCs，不著色的為活PGCs(圖3)。由此統(tǒng)計PGCs復蘇后的成活率(圖4)，結(jié)果顯示，血液中與生殖腺中分離的PGCs，均以STEM-CELLBANKER組冷凍解凍后PGCs存活率最高，達到90%左右；CELLBANKER 2 組PGCs的存活率次之，為65%左右；10%DMSO加90%血清組PGCs的存活率最低，為50%左右。3組之間統(tǒng)計學上呈顯著差異(P<0.05)。

黑色箭頭所示為死亡的PGCsThe black arrow shows the dead PGCs圖3 PGCs解凍后的臺盼藍染色Fig.3 Trypan blue staining of PGCs after thawing

同一組中不同小寫字母表示處理組之間差異顯著(P<0.05)Different small letters in the same group mean significant differences between the treatments (P<0.05)圖4 PGCs冷凍保存后的細胞存活率Fig.4 The viability of PGCs after cryopreservation

3 討論

家禽原始生殖細胞是精子或卵子的前體細胞，呈圓形或橢圓形，直徑約為15～25 μm，體積比體細胞大，比紅細胞大2倍左右，細胞核為圓形，分布在稍偏中心位置，細胞另一側(cè)有顏色較淺的脂滴[6，8]。從我們分離的鵝原始生殖細胞形態(tài)看，細胞表現(xiàn)為典型的原始生殖細胞特點，PAS染色與免疫熒光特異染色均為陽性，充分說明從鵝胚中分離的細胞為原始生殖細胞。

生殖腺消化結(jié)合體外短時間培養(yǎng)法的原理主要是利用PGCs不能貼壁，而成纖維、上皮細胞等體細胞容易貼壁的特點，通過體外短時間培養(yǎng)，既能保證大多數(shù)雜細胞能夠貼壁，又能保證PGCs的活力不降低，達到分離純化PGCs的目的。目前通過該方法已經(jīng)獲得了雞生殖腺PGCs的細胞系[7]，進一步佐證了這種方法的有效性。從鵝PGCs的分離方法看，生殖腺消化結(jié)合體外短時間培養(yǎng)法獲得的細胞數(shù)量、細胞純度與活力是效率最高的；常用的血液密度梯度離心法獲得細胞活力雖然較高，但獲得細胞數(shù)較少。ACK裂解法在鵝胚血液中分離的PGCs的純度為53.3%，與在雞胚血液中的分離純度相當(57.1%)[9]，但同其他分離方法相比獲得的細胞活力較低，可能與紅細胞裂解液對PGCs存在一定的負面影響有關(guān)。之所以生殖腺消化結(jié)合體外短時間培養(yǎng)獲得鵝PGCs的效率最高，可能取決于兩方面的因素，一是該分離方法所用試劑對細胞傷害相對較小，整個操作過程采用的試劑都是細胞常用的試劑，細胞毒性小，而密度梯度離心法使用的Ficoll和裂解法采用的ACK裂解液細胞毒性相對較大；二是該分離方法離心次數(shù)較少，降低了離心丟失的PGCs，從而提高了PGCs的獲得率。

從鵝PGCs的冷凍保護液看，CELLBANKER 2與10%DMSO加90%血清是常用的一般細胞系凍存液，對具有干細胞特性的PGCs不適合，而用于冷凍保存干細胞的STEM-CELLBANKER更適合鵝PGCs的冷凍保存，且商業(yè)化的試劑冷凍效果穩(wěn)定、使用方便；但另一方面使用成本較高，如何保證冷凍保存效果的前提下降低成本是我們下一步需要解決的問題。

目前國內(nèi)的相關(guān)研究多數(shù)為通過PGCs的體外分離培養(yǎng)，以制作嵌合體為手段進行家禽的個體發(fā)育、細胞分化及轉(zhuǎn)基因方面的研究。中國農(nóng)業(yè)大學李贊東團隊主要進行了異種嵌合體的研究，相繼開展了雞-鴨嵌合體、甲魚-鴨嵌合體等方面的工作[10-12]。揚州大學李碧春團隊主要進行了PGCs介導的轉(zhuǎn)基因方面的研究，取得一定進展[13]。浙江大學張才喬團隊主要對雞PGCs的遷移、增殖及其發(fā)育調(diào)控機理作了系統(tǒng)研究[14-15]?？梢?，國內(nèi)同行研究的焦點側(cè)重于基礎(chǔ)研究，而以種質(zhì)資源保存為目標的研究相對較少。

在家禽中，雞的PGCs的分離純化、體外培養(yǎng)與冷凍保存研究較多，相關(guān)方法技術(shù)也相對成熟。研究表明，利用雞生殖新月、生殖嵴和生殖腺都已經(jīng)成功建立PGCs細胞系[5]，能夠保障生殖嵌合體制備所需的大量PGCs。但對于鵝，目前尚無相關(guān)PGCs的分離純化及體外培養(yǎng)方法的報道。通過本實驗的探索研究，針對鵝PGCs的分離、體外培養(yǎng)與冷凍保存幾個方面的試驗，初步建立了鵝PGCs的有效分離方法和冷凍保存方法，為利用生殖嵌合體實現(xiàn)個體再生的保種目標打下基礎(chǔ)。通過冷凍保存PGCs實現(xiàn)個體再生的保種形式，既是對現(xiàn)有家禽保種方式的有效補充與有力創(chuàng)新，更可以豐富鵝遺傳資源“基因庫”，為鵝育種與品種改良及畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供保障。

[1] 湯青萍，章雙杰，郭軍，等. 太湖鵝群體遺傳多樣性研究[J]. 家畜生態(tài)學報，2010，31(1)：30-33. TANG Q P， ZHANG S J， GUO J， et al. Analysis of genetic diversity in Taihu geese[J].JournalofDomesticAnimalEcology， 2010， 31(1):30-33. (in Chinese with English abstract)

[2] 吳常信. 畜禽遺傳資源保存的理論與技術(shù)[J]. 家畜生態(tài)，2001，22 (1)：1-4. WU C X. Theory and technology of preservation in domestic animal genetic resources[J].EcologyofDomesticAnimal， 2001， 22 (1)：1-4. (in Chinese with English abstract)

[3] NAKAMURA Y， TASAI M， TAKEDA K， et al. Production of functional gametes from cryopreserved primordial germ cells of the Japanese quail[J].JournalofReproductionandDevelopment， 2013， 59(6)：580-587.

[4] NAKAMURA Y， USUI F， MIYAHARA D， et al. Efficient system for preservation and regeneration of genetic resources in chicken: concurrent storage of primordial germ cells and live animals from early embryos of a rare indigenous fowl (Gifujidori)[J].ReproductionFertilityandDevelopment， 2010， 22(8)：1237-1246.

[5] NAKAMURA Y， KAGAMI H， TAGAMI T. Development， differentiation and manipulation of chicken germ cells[J].Development,GrowthandDifferentiation， 2013， 55(1)：20-40.

[6] 韓毅冰，于康震，周琦，等. 雞胚血液中原始生殖細胞的分離及其培養(yǎng)的研究[J]. 生物技術(shù)，1996，6(2)：11-13. HAN Y B， YU K Z， ZHOU Q， et al. Studies on the isolation and culture of primordial germ cells from blood of chicken embryos[J].Biotechnology， 1996， 6(2)：11-13. (in Chinese)

[7] SONG Y， DURAISAMY S， ALI J， et al. Characteristics of long-term cultures of avian primordial germ cells and gonocytes[J].BiologyofReproduction， 2014， 90(1)：15.

[8] 李碧春，秦潔，肖小琚，等. 雞胚不同發(fā)育時期原始生殖細胞的分離方法[J]. 動物學報，2003，49(6)：835-842. LI B C， QIN J， XIAO X X， et al. A method for isolation of primordial germ cells in different stages of the chicken embryo[J].ActaZoologicaSinica， 2003， 49(6)：835-842. (in Chinese with English abstract)

[9] YAMAMOTO Y， USUI F， NAKAMURA Y， et al. A novel method to isolate primordial germ cells and its use for the generation of germline chimeras in chicken[J].BiologyofReproduction， 2007， 77(1): 115-119.

[10] 李贊東，劉春海，黃勁松，等. 雞鴨異種間嵌合體的制備[J]. 動物學報，2002，48(4):543-548. LI Z D， LIU C H， HUANG J S， et al. Preparation of Interspecies chicken (Gallusdomesticus)/duck (Anasdomesticus) chimeras[J].ActaZoologicaSinica， 2002， 48(4):543-548. (in Chinese with English abstract)

[11] ZHANG W， RUI L， ZHANG J， et al. Production of chimeras between the Chinese soft-shelled turtle and Peking duck through transfer of early blastoderm cells[J].JournalofExperimentalBiology， 2013， 216(Pt 10):1786-1792.

[12] YAN L， GAO J S， RUI L， et al. A review of strategies for producing chimeric birds[J].AvianBiologyResearch， 2014， 7(1):3-9.

[13] 孫鵬翔. 雞胚原始生殖細胞體外轉(zhuǎn)染及其介導的轉(zhuǎn)基因研究[D]. 揚州：揚州大學，2007:19-32. SUN P X. Study on the in vitro transfection and transgenic with embryonic primordial germ cells [D]. Yangzhou: Yangzhou University， 2007:19-32. (in Chinese with English abstract)

[14] 唐新燕，張才喬. 雞胚原始生殖細胞體外的分化[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2007，15(1)：20-23. TANG X Y， ZHANG C Q. Differentiation of chicken primordial germ cells in vitro[J].JournalofAgriculturalBiotechnology， 2007， 15 (1)：20-23. (in Chinese with English abstract)

[15] 葛楚天. 雞胚原始生殖細胞發(fā)育調(diào)控及其機理的研究[D]. 杭州：浙江大學，2010:38. GE C T. Regulation of the chicken primordial germ cell development [D]. Hangzhou: Zhejiang University， 2010:38. (in Chinese with English abstract)

(責任編輯 盧福莊)

Comparison of methods to isolate and cryopreserve goose primordial germ cells

YU Jianning， YAN Leyan， CHEN Zhe， SHAO Xibing， DAI Zichun， YING Shijia， SHI Zhendan*

(InstituteofAnimalScience，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，LaboratoryofAnimalImprovementandReproduction，Nanjing210014，China)

In order to establish the isolation and cryopreservation method for goose primordial germ cells (PGCs)， four kinds of PGCs separation methods，which were blood Ficoll density gradient centrifugation， blood ACK lysis method， gonads trypsin-EDTA digestion method and gonads digestion combined with short-term culture method， were compared in this experiment. And three kinds of cryoprotectors that were STEM-CELLBANKER， CELLBANKER 2 and 10% DMSO plus 90% serum were compared to evaluate the cryopreservation efficiency of goose PGCs. Morphological observation， PAS and PGCs specific immunofluorescence staining were used to verify PGCs， and trypan blue staining was used to detect the vitality of PGCs. The results showed that goose PGCs were successfully isolated from the blood and gonad of goose embryo. Gonads digestion combined with short-term culture method got the highest goose PGCs quantity， purity and vitality， reached 115 cells per embryo， 80.8% and 88.3% respectively， compared with the traditional blood separation method. Commercial stem-cell cryoprotector STEM-CELLBANKER was more suitable for cryopreservation of goose PGCs than the normal cell cryoprotectants， and the cell survival rate was about 90% after thawing. Gonads digestion combined with short-term culture method could get sufficient quantity and purity of goose PGCs. STEM-CELLBANKER could be used for the long-term cryopreservation of goose PGCs.

goose; primordial germ cells; gonads digestion combined with short-term culture; cryopreservation

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.08

2016-11-23

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[CX(14)2068]；江蘇省自然科學基金(BK20130718)

于建寧(1980—)，女，山東煙臺人，博士，副研究員，從事家禽生物技術(shù)研究。E-mail: jianningyu @aliyun.com

*通信作者，施振旦，E-mail: zdshi@jaas.ac.cn

S835；Q2-33

A

1004-1524(2017)03-0401-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 401-407

http://www.zjnyxb.cn

于建寧，閆樂艷，陳哲，等. 鵝原始生殖細胞體外分離與冷凍保存方法的比較研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(3): 401-407.