鄭雅燕，楊 穎，陸勝民，*，曹亞裙

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.浙江省健康智慧廚房系統(tǒng)集成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315336)

白蘿卜發(fā)酵飲料菌株篩選、鑒定及品質(zhì)分析

鄭雅燕1，楊 穎2，陸勝民2，*，曹亞裙3

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.浙江省健康智慧廚房系統(tǒng)集成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315336)

為篩選蘿卜乳酸型發(fā)酵飲料專用菌株，研制營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味良好的蘿卜原汁發(fā)酵飲料，對(duì)自然發(fā)酵的蘿卜原汁飲料進(jìn)行梯度稀釋、劃線分離，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析對(duì)所得菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)其發(fā)酵所得產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分、乳酸菌數(shù)量及香氣成分進(jìn)行分析。獲得5株革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)酸菌，其中YZ18產(chǎn)酸迅速、產(chǎn)香濃郁且重現(xiàn)性好，因此選作發(fā)酵蘿卜原汁初始菌株。YZ18菌落呈白色或透明，表面光滑、邊緣整齊、中央凸起，菌株傳代穩(wěn)定。經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定，YZ18為腸膜明串珠菌屬菌株，其發(fā)酵液總糖含量為21.30 g·100g-1，總酸含量為3.63 g·kg-1，pH值為3.61，酸甜適宜；乳酸菌數(shù)量級(jí)達(dá)到108cfu·mL-1。發(fā)酵液香氣成分較蘿卜原汁豐富，不僅含有酯類、硫化物，還含有烯烴類、醇類。YZ18適宜作為白蘿卜原汁乳酸發(fā)酵型飲料的發(fā)酵菌株，所得飲料酸甜可口、香味濃郁，為進(jìn)一步研制蘿卜原汁飲料提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

白蘿卜；發(fā)酵飲料；乳酸菌；腸膜明串珠菌；品質(zhì)分析

白蘿卜(RaphanussativusL.)，十字花科蘿卜屬，又名萊菔、羅服，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含較多的鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)[1-2]，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，幫助消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有解毒生津、利尿通便、保護(hù)呼吸道和促進(jìn)兒童生長(zhǎng)等功能，但蘿卜本身含有的硫苷物質(zhì)具有辛辣味，令部分人群難以接受，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)發(fā)酵能夠緩和蘿卜本身的辛辣味，提高產(chǎn)品接受度。

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌[3]，被廣泛應(yīng)用于蔬菜腌漬、乳制品加工、飼料調(diào)制等[4-6]，可分解蛋白質(zhì)成低分子的肽和氨基酸，其代謝產(chǎn)物可增加人體的腸道免疫力[7]。乳酸菌飲料發(fā)酵風(fēng)味獨(dú)特且易被人體吸收，由于其發(fā)酵作用，營(yíng)養(yǎng)成分得到改善[8-9]，也產(chǎn)生一些生理活性物質(zhì)如有機(jī)酸、芳香物質(zhì)、益生物質(zhì)、SOD、細(xì)胞壁外多糖、活性酶、乳酸菌增殖因子及乳酸菌等，對(duì)機(jī)體功能有顯著的調(diào)節(jié)作用[10-13]。乳酸發(fā)酵飲料具有原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有益生菌發(fā)酵制品的有益作用，產(chǎn)生的酸和醇類在后熟階段發(fā)生酯化反應(yīng)生成芳香物質(zhì)。因此，研制蘿卜發(fā)酵飲料，可為更多的消費(fèi)人群所接受，從而帶動(dòng)蘿卜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，果蔬原漿發(fā)酵飲料多采用自然發(fā)酵的方式，具有發(fā)酵周期長(zhǎng)、安全無(wú)法得到充分保障、工業(yè)化與標(biāo)準(zhǔn)化程度較低等缺陷，而且有關(guān)蘿卜發(fā)酵飲料也鮮有報(bào)道。采用商業(yè)菌發(fā)酵蘿卜飲料雖可解決發(fā)酵周期長(zhǎng)的問(wèn)題，但由于飲料風(fēng)味不佳而不適宜作為發(fā)酵菌株。本研究選擇浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院栽培的云南白蘿卜品種，從自然發(fā)酵的蘿卜原漿飲料出發(fā)，以風(fēng)味為主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，有針對(duì)性、目的性地篩選出蘿卜發(fā)酵專用風(fēng)味菌株，接種蘿卜原汁減輕蘿卜的辛辣味和提高接受度，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)試和鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

蘿卜選用云南白蘿卜品種，種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所楊渡基地；白砂糖購(gòu)于本地市場(chǎng)。所用試劑分別為5%苯酚、濃硫酸、50 g·L-1三氯乙酸(TCA)、0.4%磷酸-乙醇溶液、5 g·L-1BP-乙醇溶液、0.3 g·L-1FeCl3-乙醇溶液、100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液。

MRS培養(yǎng)基：OXOID，UK.出品。121 ℃滅菌20 min，用于乳酸菌的培養(yǎng)和分離。蘿卜原汁基質(zhì)：新鮮蘿卜洗凈去皮后作刨絲處理，調(diào)糖度為25%，6 h后濾出汁液，于70 ℃下滅菌30 min備用，用于乳酸菌發(fā)酵特性的研究及接種蘿卜原漿前的擴(kuò)培。

1.2 主要儀器與設(shè)備

pH計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；手持折光儀，杭州陸恒生物有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海發(fā)恩科貿(mào)有限公司；雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；CX31 光電生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司；紫外/可見(jiàn)分光光度儀UV-1800，日本島津公司；酸度滴定儀 rp20150526034，上海雷磁有限公司；GC2000-MS6100，杭州聚光科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選

自然發(fā)酵蘿卜原汁制備：蘿卜作刨絲處理，調(diào)糖度為25%，于28 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵72 h。

分離純化：吸取上述自然發(fā)酵液加入生理鹽水中搖勻后進(jìn)行梯度稀釋，取適宜稀釋梯度的發(fā)酵液涂布MRS瓊脂平板，于30 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h，挑取具有溶鈣圈及典型乳酸菌菌落特征的單菌落進(jìn)行平板劃線并保存?zhèn)溆谩?/p>

初篩：對(duì)不同菌株編號(hào)并進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和形態(tài)觀察，選擇革蘭氏陽(yáng)性菌且發(fā)酵性能良好、傳代穩(wěn)定的菌株進(jìn)行后續(xù)篩選。

復(fù)篩：將不同編號(hào)的菌株按5%接種量分別接種到蘿卜原汁基質(zhì)中，28 ℃厭氧恒溫發(fā)酵，每12 h進(jìn)行pH值測(cè)定，48 h后按表1所示標(biāo)準(zhǔn)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，最終確定產(chǎn)酸性能優(yōu)良的菌株。

1.3.2 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將發(fā)酵菌株于MRS培養(yǎng)基上，30 ℃厭氧恒溫培養(yǎng)，3 d后觀察菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地，革蘭氏染色后觀察菌體形態(tài)。生理生化鑒定：委托浙江省微生物研究所采用梅里埃VITTEK2 COMPAACT全自動(dòng)微生物生化鑒定儀。

16S rDNA序列測(cè)定及分析：委托浙江省微生物研究所進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定。登錄http://www.ncbi.nlm.nih.gov/使用Blast工具進(jìn)行同源序列搜索后找到其對(duì)應(yīng)的模式菌株，比較該菌株與模式菌株序列間的堿基同源率。為顯示菌株間的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育地位，將該菌株的16S rDNA序列與模式菌株應(yīng)用ClustW進(jìn)行多序列匹配比對(duì)，用MEGA6.06采用相鄰連接方法(Neighbor-Joining)進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以顯示菌株間的親緣關(guān)系。

1.3.3 蘿卜原漿發(fā)酵前后基本成分含量對(duì)比及菌數(shù)測(cè)定

取蘿卜原汁(打漿后濾出獲得)、蘿卜糖腌浸出液(調(diào)糖至25%并置于28 ℃培養(yǎng)箱3 h)及接種發(fā)酵后的發(fā)酵液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)和乳酸菌數(shù)測(cè)定?？偹岷坎捎盟岫鹊味▋x測(cè)定，以乳酸計(jì)[14]。總糖含量采用苯酚硫酸法測(cè)定[15]。Vc含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測(cè)定[16]。pH值采用pH計(jì)測(cè)定[17]?？扇苄怨绦挝锊捎冒⒇愓酃?/p>

儀測(cè)定[18]。乳酸菌數(shù)測(cè)定：取發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋，涂布MRS瓊脂平板，于30 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h，對(duì)菌落數(shù)在30～300范圍內(nèi)的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[19-20]。

1.3.4 蘿卜原漿發(fā)酵前后香氣成分測(cè)定

采用固相微萃取(SPME)聯(lián)合氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MS)測(cè)定蘿卜原漿、糖腌浸出液及接種發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[21]。

(1)分析條件

氣相條件：進(jìn)樣口：250 ℃，柱流量 0.8 min·L-1，不分流進(jìn)樣，載氣吹掃：1.5 min 后設(shè)置為11 mL·min-1。質(zhì)譜條件：離子阱溫度：180 ℃，氣質(zhì)接口：250 ℃，真空腔：50 ℃。升溫程序： 55 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1升至90 ℃后保持1 min，最后以5 ℃·min-1升至250 ℃并保持5 min。

(2)定性分析

色譜分離后，質(zhì)譜掃描每個(gè)色譜峰得到質(zhì)譜圖，所得質(zhì)譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)確定香氣物質(zhì)組分種類[22]。

(3)定量分析

按面積歸一化法計(jì)算各組分含量。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，選擇3-壬酮為內(nèi)標(biāo)，其濃度為0.4 g·L-1，體積為5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的篩選

通過(guò)分離純化獲得36株純菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察，其中24株菌的菌落呈白色或透明，表面光滑、邊緣整齊、中央凸起，具有明顯的乳酸菌菌落特征，取這24株菌株進(jìn)行后續(xù)篩選。通過(guò)測(cè)定菌株接入后蘿卜飲料的pH值和感官評(píng)定值隨發(fā)酵時(shí)間的變化來(lái)確定最適菌株。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 The standard of sensory evaluation

項(xiàng)目(分值)Items(Score)特征描述Characterdescription等級(jí)Grade評(píng)分Score香味Flavor(20分)甜香濃郁,淡淡的酒精味Richsweetodorandslightsmellofalcohol一級(jí)First18～20香味稍淡或酒精味稍重,無(wú)異味Slightfragrance,smellofalcohol,noun-pleasantsmell二級(jí)Second15～17無(wú)香味或酒精味極重,異味大Nofragrance,heavysmellofalcohol,un-pleasantsmell三級(jí)Third1～14色澤Color(20分)均勻乳白色,無(wú)沉淀Harmoniouscolorofcreamwhite,nodeposition一級(jí)First18～20顏色較深或較淡,少許沉淀Toodeeporslightcolor,alittledeposition二級(jí)Second15～17色澤極不協(xié)調(diào),極多沉淀Uglycolor,manydeposition三級(jí)Third1～14口感Taste(40分)酸甜適度Moderatesweetandsour一級(jí)First36～40偏酸或偏甜Alittlesourorsweet二級(jí)Second29～35極酸或極甜Verysourorsweet三級(jí)Third1～28爽口度Refreshingdegree入口爽滑易吞咽Refreshingandeasytoswallow一級(jí)First18～20(20分)爽口度一般Notsogoodandnotsobad二級(jí)Second15～17微澀不易吞咽Alittleastringentandhardtoswallow三級(jí)Third1～14

2.1.1 產(chǎn)酸性能測(cè)定

于接種發(fā)酵后12、24、36、48、60 h進(jìn)行pH值測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，滅菌后未接菌的蘿卜原汁pH值為6.15，各菌株接入后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜汁的pH值呈不斷下降的趨勢(shì)，且均在48 h后呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。YZ1、YZ2、YZ5、YZ17、YZ18、YZ19、YZ23菌株發(fā)酵汁的pH值下降速度均較快，在36 h時(shí)，YZ1、YZ2、YZ5、YZ17、YZ18、YZ19、YZ23的pH值由6.15分別下降為3.67、3.61、3.67、3.64、3.65、3.69和3.65，其余菌株pH變化均較緩慢。

2.1.2 感官評(píng)定

將編號(hào)為1～24的乳酸菌按5%接種量分別接種到糖度值為25%的已滅菌的蘿卜原汁中，28 ℃厭氧恒溫發(fā)酵，于發(fā)酵48 h后從香味、色澤、口感、爽口度四個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定感官值最優(yōu)的菌株發(fā)酵飲料，感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)合表1及圖1的結(jié)果看，菌株接種飲料在pH值下降為3.61時(shí)的感官評(píng)分值最高，其色澤、香味、口感和爽口度四項(xiàng)指標(biāo)分值均較高。YZ2和YZ5的總評(píng)分值分別為69和70，由表1可知，兩者的發(fā)酵液在48 h時(shí)pH值下降速度較快，分別為3.39和3.46，酸甜感失衡，從而影響其感官評(píng)分值；YZ1和YZ19的總評(píng)分值分別為76和81，在48 h時(shí)的pH值分別為3.58和3.63，雖數(shù)值與3.61相差不大，但其外觀色澤及爽口度均有所不足；YZ17、YZ18、YZ23號(hào)接種飲料感官總評(píng)分值分別為 85、87、85，結(jié)合表1可知，其pH值下降速度較快，在48 h時(shí)pH值均為3.61，且在60 h進(jìn)行測(cè)定時(shí)也均為3.61，處于穩(wěn)定狀態(tài)。綜合考慮確定YZ18為發(fā)酵蘿卜原漿飲料的最適菌株。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及細(xì)菌染色鑒定

表2 不同編號(hào)菌株接種蘿卜飲料的pH值變化

Table 2 Changes of pH value in radish juice inoculated by different codes of strains

編號(hào)Number時(shí)間Time/h1224364860YZ14.413.873.673.583.55YZ24.403.783.613.393.39YZ34.984.033.963.603.51YZ44.964.323.873.573.55YZ54.183.833.673.463.45YZ64.973.943.703.613.58YZ74.493.933.703.613.59YZ84.633.903.713.633.62YZ94.243.913.743.703.68YZ104.183.903.743.703.68YZ114.153.873.723.603.58YZ124.843.943.733.613.58YZ134.513.903.733.633.63YZ144.933.933.733.623.60YZ154.923.953.723.613.61YZ164.893.933.723.613.60YZ174.103.813.643.613.61YZ184.273.863.653.613.61YZ194.133.863.693.633.63YZ204.123.873.703.623.61YZ214.523.933.733.633.62YZ224.253.893.723.503.50YZ234.243.853.653.613.61YZ244.533.893.713.613.61

圖1 不同菌株接種對(duì)蘿卜飲料的感官總評(píng)分值的影響(編號(hào)1-24)Fig.1 Effect of different strains on total values of sensory evaluation of radish juices (No. 1-24)

YZ18的菌落形態(tài)如圖2所示。在MRS培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)48 ℃厭氧培養(yǎng)后，培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出大小幾乎一致的圓形菌落，直徑約1 mm，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變大。瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)表面光滑、邊緣整齊和中央凸起的白色或透明菌落。從分離培養(yǎng)基上挑取菌落，涂片，革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果表明，該菌為革蘭氏陽(yáng)性，成雙球狀、四球狀或成短鏈狀排列的球狀細(xì)菌。

2.2.2 生理生化鑒定

根據(jù)表3菌株糖發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果，經(jīng)自動(dòng)判讀數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定，YZ18為明串珠菌(Leuconostocmesenteroidiessubsp. mesenteroidies)，鑒定值為99%。

2.2.3 菌株16SrDNA序列分析

基因分析結(jié)果表明，YZ18的16S rDNA序列與腸膜明串珠菌屬(Leuconostocmesenteroidessubsp.)

a， 菌落形態(tài)正面； b， 革蘭氏染色鏡檢圖片a， Positive colonial morphology； b， Opposite colonial morphology圖2 YZ18的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢圖片F(xiàn)ig.2 Colonial morphology and Gram stain microscopy picture of YZ18 strain

的相似度達(dá)97%。用MEGA6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見(jiàn)圖3，同一屬菌株被歸在同一主分支內(nèi)，表明其親緣關(guān)系較近，分支處數(shù)值為支持率，圖中比例尺為核酸分離度(0.002)。結(jié)合形態(tài)分析結(jié)果，鑒定該菌為腸膜明串珠菌屬(Leuconostocmesenteroidessubsp.)，將其命名為L(zhǎng)euconostocmesenteroidessubsp.YZ18。

圖3 基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建YZ18的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of YZ18 based on 16S rDNA sequence homology analysis

2.3 主要營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比、細(xì)菌數(shù)及乳酸菌數(shù)測(cè)定

由表4可見(jiàn)，蘿卜原汁總糖含量為4.00 g·100g-1，加入25%糖腌后，浸出液的總糖含量迅速上升達(dá)到23.40 g·100g-1，接種發(fā)酵后總糖含量略微下降為21.30 g·100g-1。原汁總酸含量為0.45 g·kg-1，糖腌浸出液總酸含量有所下降，而接種發(fā)酵后總酸含量達(dá)到了3.63 g·kg-1，賦予飲料微酸的口感。原汁Vc含量為11.93 mg·100g-1，糖腌浸出液Vc含量有所下降，發(fā)酵液Vc含量下降為3.93 mg·100g-1。原汁pH為5.99，浸出液pH為6.15，發(fā)酵液pH迅速下降為3.61，酸甜度為最佳狀態(tài)。原汁可溶性固形物為5.8%，浸出液可溶性固形物為25.0%，發(fā)酵液可溶性固形物略微下降為23.7%。原汁乳酸菌數(shù)數(shù)量級(jí)為104cfu·mL-1，糖腌浸出液乳酸菌數(shù)數(shù)量級(jí)無(wú)變化，同為104cfu·mL-1，發(fā)酵液乳酸菌數(shù)數(shù)量級(jí)達(dá)到108cfu·mL-1，與市面上活性乳酸菌飲料的乳酸菌數(shù)數(shù)量級(jí)一致[23]，起調(diào)節(jié)腸道的益生作用。

2.4 蘿卜原汁及發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

2.4.1 蘿卜風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖

如圖4所示，編號(hào)1為蘿卜原汁，編號(hào)2為糖腌浸出液，編號(hào)3為接種發(fā)酵液。三者均獲得清晰的離子譜圖，說(shuō)明所采用的氣相色譜條件符合分析要求。

表3 YZ18糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

Table 3 Utilization of different carbon sources by YZ18

項(xiàng)目Items結(jié)果Result項(xiàng)目Items結(jié)果Result項(xiàng)目Items結(jié)果Result苦杏仁苷Amygdalin+D-木糖D-xylose+D-甘露醇D-mannitol+磷酸酶Phosphatase尿素酶UreaseD-山梨醇D-sorbitolD-棉子糖D-raffinoseα-甘露糖苷酶α-mannosidase磷脂酰磷脂酶CPhospholipidphospholipaseCβ-D-半乳糖苷酶β-D-galactosidase---+---乳糖Lactose蔗糖SucroseD-核糖D-Ribose支鏈淀粉Amylopectin環(huán)式糊精CyclodextrinD-麥芽糖D-Maltose焦谷氨酸芳胺酶Pyroglutamicarylamidase-+---+-D-海藻糖D-trehalose水楊素SalicinD-甘露糖D-mannoseD-半乳糖D-galactoseα-葡萄糖苷酶α-glucosidase0/129耐受Toleranceof0/129新生霉素耐受Toleranceofnovobiocin+++-+-+精氨酸雙水解酶1Argininedihydrolase1-β-D-葡萄糖苷酸酶β-D-glucuronidase-6.5%NaCl生長(zhǎng)Growthon6.5%NaCl-丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶-丙氨酸芳胺酶Alaninearylamidase-桿菌肽耐受Toleranceofbacitracin+Alanine-phenylalanine-prolinearylamidase絡(luò)氨酸芳胺酶Tyrosinearylamidase-甲基-B-D-葡萄糖吡喃苷Methyl-B-D-glucopyranoside+L-天冬氨酸芳胺酶L-Aspartatearylamidase-多粘菌素B耐受ToleranceofPolymyxinB-精氨酸雙水解酶2Argininedihydrolase2-β-半乳糖吡喃糖苷酶β-Galactoseglucosidase-亮氨酸芳胺酶Leucinearylamidase-奧普托欣耐受Toleranceofoptochin+L-脯氨酸芳胺酶Prolinearylamidase-L-乳酸鹽產(chǎn)堿L-lactateproducingalkali-β-葡萄糖氨酸酶β-glucosaminidase-N-乙酰-D-葡萄糖胺N-acetyl-D-glucosamine+α-半乳糖苷酶α-galactosidase++

表4 蘿卜原汁、浸出液及發(fā)酵液的指標(biāo)測(cè)定

Table 4 Index measurment of radish original juice， leaching agent and fermentation liquor

指標(biāo)Indicator總糖Totalsugar/(g·100g-1)總酸Totalacid/(g·kg-1)Vc/(mg·100g-1)pH可溶性固形物Solublesolid/%乳酸菌Lacticacidbacteria/(cfu·mL-1)蘿卜原汁Radishoriginaljuice4.00.4511.935.995.81.0×104浸出液Leachingagent23.400.375.546.1525.02.0×104發(fā)酵液Fermentionliquor21.303.633.933.6123.72.9×108

圖4 SPME萃取蘿卜原汁、浸出液及發(fā)酵液揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile compounds of radish original juice， leaching agent and fermentation liquor by SPME and GC-MS

2.4.2 固相微萃取萃取化合物的數(shù)量和種類

蘿卜原汁、糖腌浸出液及發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味的化學(xué)成分及相對(duì)百分含量見(jiàn)表5。蘿卜原汁、糖腌浸出液及發(fā)酵液經(jīng)SPME及GC-MS檢測(cè)，其揮發(fā)性風(fēng)味成分主要為酯類、硫醚類、烯烴類等。三組檢測(cè)到的硫化物完全相同，均為二甲基二硫和二甲基三硫，原汁硫化物含量達(dá)到56.99%，浸出液硫化物為87.73%，發(fā)酵液為63.12%，且二甲基二硫的含量均較高，分別為53.82%、77.61%和56.63%。所檢測(cè)到的酯類組成具有明顯差別，原汁檢測(cè)到的酯類主要有異硫氰酸戊酯、異硫氰酸己酯、1-異硫代氰酸庚酯、3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯等，此類物質(zhì)含有刺鼻味道，是蘿卜辛辣味的主要來(lái)源[24]，而在發(fā)酵液中沒(méi)有檢測(cè)到此類物質(zhì)。

表5 蘿卜原汁、浸出液、發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)百分含量

Table 5 Flavor compounds and its relative percentage in radish original juice， leaching agent and fermentation liquor

化合物Compounds相對(duì)含量Relativeamount/%原汁Originaljuice糖腌浸出液Leachingagent接種發(fā)酵液Fermentationliquor硫化物Sulfide 二甲基二硫2,3-Dithiabutane53.8277.6156.63 二甲基三硫Dimethyltrisulfide3.1710.126.49酯類Esters 異硫氰酸戊酯n-Pentylisothiocyanate1.49—— 4-甲基異硫氰酸戊酯4-Methylpentylisothiocyanate12.812.83— 異硫氰酸己酯n-Hexylisothiocyanate5.37—— 1-異硫代氰酸庚酯n-Heptylisothiocyanate0.790.23— 3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯3-Methylthiopropylisothiocyanate2.570.57— 4-甲硫基-3-丁烯基-異硫氰酸戊酯A4-Methylthio-3-butenylisothiocyanateA2.220.94— 4-甲硫基-3-丁烯基-異硫氰酸戊酯B4-Methylthio-3-butenylisothiocyanateB2.850.32— β-異硫氰酸苯乙酯β-Phenethylisothiocyanate0.290.16— 異硫氰酸己酯n-Hexylisothiocyanate—1.15— 癸酸乙酯Ethylcaprate—0.192.07 乙酸異戊酯Isopentylacetate——7.01 正己酸乙酯Ethylhexanoate——6.09 辛酸乙酯Ethylcaprylate——11.34 反式-4-癸烯酸乙酯Ethyltrans-4-decenoate——0.81烯烴類Olefin 雙戊烯Limonene0.661.043.16 α-姜黃烯α-Curcumene——1.12 β-甜沒(méi)藥烯β-Bisabolene——0.57 β-倍半水芹烯β-Sesquiphellandrene——0.45醚類Ethers 正-午基醚n-Octylether—1.390.44醇類Alcohol 薄荷醇Menthol——1.5酚類Phenols 2,4-二叔丁基苯酚2,4-Di-tert-butylphenol——0.31其他Others 5-(2-丙烯基)-2(5H)-噻吩酮5-(2-Propenyl)-2(5H)-thiophenone1.890.27— 5-硝基茚5-Nitroindene12.342.04— ε-硫代己內(nèi)酰胺ε-Thiocaprolactam0.41—— 香葉基丙酮Geranylacetone—0.18— BETA-細(xì)辛腦cis-Asarone—0.42— 1,3-二叔丁基苯1,3-Di-tert-butylbenzene——0.63

發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味成分較為豐富，除了含有硫化物、酯類和烯烴類外，還含有醇類、酚類和醚類。發(fā)酵液中檢測(cè)到的特有酯類物質(zhì)均為食品用香料，為具有水果香型的有機(jī)酸酯類，如乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯，是發(fā)酵液特征風(fēng)味的主要來(lái)源，酯類組成類別較少，但總含量沒(méi)有降低，總含量達(dá)到27.32%；特有的烯烴類物質(zhì)，如α-姜黃烯、β-甜沒(méi)藥烯及β-倍半水芹烯均具有藥物作用[25]，可清熱消腫、抗炎鎮(zhèn)痛；特有的DL-薄荷醇是常見(jiàn)于花露水中的賦香劑，起殺菌作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從自然發(fā)酵的風(fēng)味優(yōu)良的蘿卜汁中篩選得到1株產(chǎn)酸較快且發(fā)酵風(fēng)味良好的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA測(cè)序分析將其鑒定為腸膜明串珠菌屬(Leuconostocmesenteroidessubsp.)菌株，并命名為L(zhǎng)euconostocmesenteroidessubsp.YZ18。該菌株適合于含糖量25%的蘿卜原汁在28 ℃發(fā)酵，產(chǎn)酸速度快，且風(fēng)味良好、穩(wěn)定。后期將結(jié)合來(lái)源于發(fā)酵蘿卜原汁的乳酸菌進(jìn)行混合發(fā)酵，進(jìn)一步增加其風(fēng)味與應(yīng)用價(jià)值。人工接種該菌株及乳酸菌可解決蘿卜汁發(fā)酵飲料生產(chǎn)周期長(zhǎng)、安全系數(shù)不高和質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題，也可為其他發(fā)酵飲料的研發(fā)提供技術(shù)參考。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Screening， identification and quality analysis of fermented strains for white radish beverage

ZHENG Yayan1， YANG Ying2， LU Shengmin2，*， CAO Yaqun3

(1.CollegeofChemistryandLifeScience，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321000，China; 2.InstituteofFoodScience，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，KeyLaboratoryofFruitsandVegetablesPostharvestandProcessingTechnologyResearchofZhejiangProvince，Hangzhou310021，China; 3.KeyLaboratoryofHealthyandIntelligentKitchenSystemIntegrationofZhejiangProvince，Ningbo315336，China)

To screen the special lactic acid strains of radish fermented drink and develop the beverages with good nutrition and flavor， the gradient dilution and streaking were carried out on the natural fermentation liquid of radish raw juice. The special strain was identified according to the morphological characteristics， physiological and biochemical test and 16S rDNA sequence analysis， and the nutrient composition， lactic acid bacteria quantity and aroma components of obtained products were analyzed. The results showed that 5 strains of gram-positive bacteria producing acid were obtained， among which， strain YZ18 was developed with white or transparent colonies， smooth surface， regular edge and central bulge， and it was stable after culture and passage. YZ18 was selected as a special strain to inoculate radish juice and it produced acid rapidly with good smells and reproducibility. YZ18 was identified asLeuconostocmesenteroidesstrain by 16S rDNA sequence analysis appraisal. The total sugar content， total acid content and pH value of the fermented liquid were 21.30 g·100 g-1， 3.63 g·kg-1and 3.61， respectively. The magnitude of lactic acid bacteria reached 108cfu·mL-1. Aroma components in the fermented liquid were richer than those in radish juice and it contained not only esters， sulfide but alkenes and alcohols. In conclusion， strain YZ18 is suitable to ferment the acid fermented beverages of white radish juice. The drink is sweet and delicious with strong fragrance， and this study provides a technical basis for the further development of radish juice beverage.

white radish; fermented beverage; lactic acid bacteria;Leuconostocmesenteroides; quality analysis

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.22

2016-11-07

杭州市重大科技創(chuàng)新專項(xiàng)(20131812A32)；寧波市公益類重大專項(xiàng)(2015C110012)

鄭雅燕(1991—)，女，福建漳州人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ-mail: zyayan@yeah.net

*通信作者，陸勝民，E-mail： lushengmin@hotmail.com

TS275.5

A

1004-1524(2017)03-0506-09

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 506-514

http://www.zjnyxb.cn

鄭雅燕，楊穎，陸勝民， 等. 白蘿卜發(fā)酵飲料菌株篩選、鑒定及品質(zhì)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(3): 506-514.