胡碩強(qiáng)+曹樹軍++韓蘭唐++邢成偉++謝剛++柳景華

[摘要] 目的 探討FGF21對H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷及Angpt2、GLUT1表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞并分為H9C2組、H/R組、H/R+FGF21組，H9C2組即H9C2細(xì)胞陰性對照組，H/R組給予缺氧6 h/復(fù)氧24 h處理，H/R+FGF21組則在細(xì)胞復(fù)氧時給予FGF21（1 μg/mL）處理。利用FCM檢測各組細(xì)胞凋亡率，QPCR及Western blot檢測各組Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表達(dá)水平。 結(jié)果 H/R組細(xì)胞凋亡率顯著高于H9C2組（P < 0.01）。與H/R組比較，H/R+FGF21組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P < 0.01）。QPCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與H9C2組比較，H/R組Angpt2、Caspase-3表達(dá)顯著增加，GLUT1表達(dá)顯著降低（P < 0.01）；與H/R組比較，H/R+FGF21組Angpt2、Caspase-3表達(dá)顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），GLUT1表達(dá)顯著增加（P < 0.05）。 結(jié)論 外源性FGF21可顯著減輕H/R損傷所致H9C2細(xì)胞凋亡，抑制炎癥因子Angpt2表達(dá)和增加GLUT1表達(dá)可能是其內(nèi)在機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] FGF21；H9C2細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧損傷；Angpt2；凋亡

[中圖分類號] R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0032-05

再灌注治療是改善急性心肌梗死患者預(yù)后的根本措施，其在增加供血、挽救瀕死心肌之外，也會引起無復(fù)流、心肌細(xì)胞凋亡和壞死、再灌注心律失常、心功能惡化等，稱之為缺血/再灌注（I/R）損傷。心肌I/R損傷是患者心功能惡化和不良預(yù)后的主要原因，其機(jī)制復(fù)雜，涉及心肌細(xì)胞凋亡、能量代謝障礙、炎癥損傷等。成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）21是一種內(nèi)分泌型FGF，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、改善能量代謝、抑制心肌凋亡等心血管保護(hù)作用[1]，但其內(nèi)在機(jī)制仍不完全清楚。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）1是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞有氧糖代謝的關(guān)鍵步驟，是一種內(nèi)源性保護(hù)因子。血管生成素2（Angpt2）是血管生成素家族中最為重要的成員之一，Angpt2作為一種炎癥因子參與了多種病理生理過程包括感染性休克、急性心肌梗死、同種異體心臟移植I/R損傷、移植心臟血管病等[2-3]。本研究利用H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷模型模擬心肌I/R損傷，旨在探討外源性FGF21（rhFGF21）對H9C2心肌細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用及對Angpt2和GLUT1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 H9C2細(xì)胞購買于ATCC（CRL-1446）。

1.1.2 主要試劑 rhFGF21（美國ABNOVA，P5989，純度> 95%）；DMEM-高糖培養(yǎng)基（Hyclone，Cat.No.SH30022.01B）；胎牛血清（Gibco，Cat.No.10099-141）；Annexin V/PI apoptosis kit（聯(lián)科生物，AP101）；Trizol（TAKARA公司產(chǎn)品）；RT-PCR試劑（DBI公司產(chǎn)品）；RNasin（美國Promega公司產(chǎn)品）等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 低速離心機(jī)（Anke/飛鴿，TDL-80-2B）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Memmer，INC108）；缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱（SANYO三洋，MCO-5M）；倒置顯微鏡（MOTIC）；流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSCalibur）；酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀（Thermo Fisher Scientific，multiscan MK3）；Real Time PCR儀（美國Agilent公司）；SDS-PAGE垂直電泳槽（北京凱元伯樂生物科技有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H9C2細(xì)胞H/R模型建立 將H9C2細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2。當(dāng)細(xì)胞密度> 90%時，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。10% FBS的DMEM培養(yǎng)基更換為PBS，在缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱充入95% N2 10 min后，把缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧（O2含量約為2%）6 h，然后去掉PBS，重新加入含10% DMEM的培養(yǎng)基，置于37℃，20% O2， 5%CO2中繼續(xù)培養(yǎng)24 h（即缺氧6 h/復(fù)氧24 h）。

1.2.2 給藥方法 在細(xì)胞復(fù)氧時給予rhFGF21治療，rhFGF21凍干粉直接配置于再灌注液（含10% DMEM的培養(yǎng)基）中，濃度為1 μg/mL，為防止其降解，現(xiàn)配現(xiàn)用，藥液不做保存。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分三組：H9C2組、H/R組、H/R+FGF21組。H9C2組即H9C2細(xì)胞陰性對照組，H/R組給予缺氧6 h/復(fù)氧24 h處理，F(xiàn)GF21組則在細(xì)胞復(fù)氧時給予FGF21（1 μg/mL）處理。

1.2.4 檢測指標(biāo) 利用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測各組H9C2細(xì)胞凋亡率，利用QPCR及Western blot檢測各組H9C2細(xì)胞Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；方差不齊進(jìn)行Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡情況比較

H9C2組細(xì)胞凋亡率為（9.17±1.12）%（圖1A）；H/R組細(xì)胞凋亡率為（38.87±3.71）%（圖1B）；H/R+FGF21組細(xì)胞凋亡率為（24.80±1.95）%（圖1C）；H/R組細(xì)胞凋亡率顯著高于H9C2組（P < 0.01），H/R+FGF21組細(xì)胞凋亡率顯著低于H/R組（P < 0.01）（圖1D）；表明H9C2心肌細(xì)胞H/R損傷模型建立成功，F(xiàn)GF21干預(yù)可以顯著抑制H/R損傷所致H9C2細(xì)胞凋亡。

2.2 各組Angpt2、GLUT1、Caspase-3 mRNA表達(dá)情況比較

與H9C2組比較，H/R組Angpt2 mRNA表達(dá)顯著升高（P < 0.01，圖2A），GLUT1 mRNA表達(dá)顯著降低（P < 0.01，圖2B），Caspase-3 mRNA表達(dá)顯著升高（P < 0.01，圖2C）；與H/R組比較，H/R+FGF21組Angpt2 mRNA表達(dá)顯著降低（P < 0.01，圖2A），GLUT1 mRNA表達(dá)升高（P < 0.05，圖2B），Caspase-3 mRNA表達(dá)降低（P < 0.05，圖2C）。

2.3 各組Angpt2、GLUT1、Caspase-3蛋白表達(dá)情況比較

H9C2組、H/R組、H/R+FGF21組細(xì)胞中Angpt2和Caspase-3的表達(dá)趨勢相似，均為H/R組 > H/R+FGF21組 > H9C2組；GLUT1的表達(dá)水平由低到高依次為H/R組 < H/R+FGF21組 < H9C2組。圖3。

3 討論

細(xì)胞凋亡在心肌I/R損傷的病理生理過程中起重要作用。心肌I/R損傷通過多種機(jī)制誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，比如能量代謝障礙、氧自由基增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷、炎癥損傷等。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R組細(xì)胞凋亡率顯著高于H9C2組，表明H9C2心肌細(xì)胞H/R損傷模型建立成功；在細(xì)胞復(fù)氧同時給予rhFGF21（1 μg/mL）處理可以顯著抑制細(xì)胞凋亡、提高存活率，表明外源性FGF21具有抗凋亡等心肌保護(hù)作用。已知細(xì)胞凋亡的途徑有死亡受體介導(dǎo)途徑、線粒體介導(dǎo)途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)途徑等， Caspase在各種途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著核心作用，是細(xì)胞凋亡激活的必由之路，Caspase-3處于細(xì)胞凋亡信號通路的下游，是凋亡通路中的重要信號分子，Caspase-3斷裂激活能直接水解底物，包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)與DNA修復(fù)、復(fù)制，RNA剪切和細(xì)胞骨架等相關(guān)的蛋白質(zhì)，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此Caspase-3常作為細(xì)胞凋亡的檢測指標(biāo)。本研究利用QPCR和Western blot檢測Caspase-3表達(dá)，結(jié)果顯示，H/R損傷誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)顯著增加；給予rhFGF21處理后能顯著抑制Caspase-3表達(dá)，說明rhFGF21可以通過某些通路抑制Caspase-3的斷裂激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。

FGF21是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種FGF，屬于FGF家族（FGFs），主要由肝臟、脂肪組織、胰腺、骨骼肌等分泌，作為一種內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)糖脂代謝，增加胰島素敏感性，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，降低體重和改善肝脂肪變性等，且無增殖、低血糖、水腫等副作用，有望成為一種新的降糖、調(diào)脂和治療肥胖的藥物。GLUT是細(xì)胞膜上的一種跨膜糖蛋白，負(fù)責(zé)葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在心肌中表達(dá)的GLUT形式主要有GLUT1和GLUT4。心肌缺血時位于細(xì)胞器膜的GLUT1和保存于囊泡內(nèi)的GLUT4迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿膜，使心肌細(xì)胞攝取更多的葡萄糖以代償缺血心肌能量利用失衡。GLUT1是FGF21作用底物之一，GLUT1是心肌細(xì)胞攝取葡萄糖的限速步驟，現(xiàn)已知增加心肌細(xì)胞葡萄糖攝取和糖酵解代謝可以抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究初步探討了GLUT1在心肌細(xì)胞H/R損傷中的改變及rhFGF21干預(yù)對其的影響。本研究利用QPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)H/R抑制心肌細(xì)胞GLUT1表達(dá)，而給予rhFGF21處理可顯著增加GLUT1表達(dá)。目前認(rèn)為GLUT1在心肌缺血、缺氧時可作為一種內(nèi)源性保護(hù)因子[4-6]。FGF21上調(diào)H9C2細(xì)胞GLUT1表達(dá)可能通過以下機(jī)制發(fā)揮心肌保護(hù)作用：①GLUT1表達(dá)增加將增加心肌細(xì)胞復(fù)氧時對葡萄糖的攝取，抑制脂肪酸氧化，優(yōu)化細(xì)胞能量代謝[7]；②GLUT1作為缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）、Akt下游靶基因，推測FGF21通過Akt-GLUT1-cJNK途徑抑制凋亡等[4，7]；③通過激活線粒體ATP敏感性鉀通道，維持心肌細(xì)胞和線粒體膜穩(wěn)定性，保護(hù)線粒體功能，減少再灌注心律失常等[8]。

此外，炎癥在I/R損傷和細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展中也起重要作用，心肌I/R時可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等表達(dá)和分泌炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子，比如TNF-α、ICAM-1、IL-6、VEGF等，引起白細(xì)胞黏附、聚集和激活，導(dǎo)致細(xì)胞組織損傷和無復(fù)流等微循環(huán)障礙。基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可通過抗炎、促血管生成等機(jī)制發(fā)揮抗I/R損傷等心血管保護(hù)作用，但其內(nèi)在機(jī)制并不完全清楚。近年來，兼有促血管生成和致炎作用的Angpt2在心肌I/R損傷中的作用日益引起重視[2]，已有學(xué)者將其作為判斷病情嚴(yán)重性與預(yù)后的一種新型標(biāo)志物和炎癥分子[9-12]。多數(shù)研究提示，在心肌I/R損傷時Angpt2表達(dá)增加并發(fā)揮促凋亡作用[13-16]。本研究首次探討了H9C2心肌細(xì)胞H/R損傷及rhFGF21干預(yù)對Angpt2表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，H9C2心肌細(xì)胞H/R損傷可以顯著增加Angpt2表達(dá)，而FGF21減輕H/R損傷同時顯著抑制Angpt2表達(dá)，提示抑制Angpt2表達(dá)可能是FGF21抗凋亡的心肌保護(hù)機(jī)制之一。但目前Angpt2促凋亡機(jī)制并不清楚，有待進(jìn)一步研究揭示。

目前文獻(xiàn)報道涉及FGF21抗心肌凋亡作用的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)途徑和機(jī)制主要有以下幾個方面：①FGF21可以內(nèi)分泌激素形式作用于心肌，通過激活FGFR1/β-Klotho-PI3K-Akt1-BAD細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)，最終抑制Caspase-3活性而減少心肌細(xì)胞凋亡[17-18]；②外源性FGF21通過Akt-GSK-3β-Caspase-3依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑減輕H9C2細(xì)胞I/R損傷，減輕氧化應(yīng)激、改善能量代謝，抑制TNF-α和PAI-1等炎癥因子表達(dá)[19]；③骨骼肌來源的FGF21可以脂聯(lián)素依賴方式顯著減輕鼠心肌梗死，改善心功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成及抑制炎癥因子釋放等[20]。

總之，外源性FGF21可通過上調(diào)GLUT1表達(dá)改善細(xì)胞能量代謝，以及下調(diào)促炎因子Angpt2表達(dá)等機(jī)制，顯著減輕H/R損傷所致H9C2細(xì)胞凋亡，具有抗心肌I/R損傷的有益作用。

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（收稿日期：2016-10-29 本文編輯：李亞聰）