房德芳,石微,房新建,蘇瓊

(1江蘇省連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校,江蘇連云港222006;2連云港市第二人民醫(yī)院)

HOXA3在乳腺癌組織中的表達(dá)及其對患者預(yù)后、細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

房德芳1,石微1,房新建2,蘇瓊1

(1江蘇省連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校,江蘇連云港222006;2連云港市第二人民醫(yī)院)

目的研究同源盒基因3(HOXA3)在乳腺癌組織中的表達(dá)及其對患者預(yù)后、乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)的影響。方法用qPCR法檢測30例乳腺癌組織、癌旁組織中HOXA3 mRNA，同時(shí)對TCGA數(shù)據(jù)庫中的患者根據(jù)HOXA3平均值分為HOXA3高表達(dá)與低表達(dá)，并通過生存分析比較生存率與轉(zhuǎn)移率的差異。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7隨后分為CON、siRNA1、siRNA2組，分別轉(zhuǎn)染無效siRNA、HOXA3 siRNA1、HOXA3 siRNA2小干擾RNA，48 h后通過qPCR、Western blotting法檢測HOXA3 RNA和蛋白表達(dá)，篩選出干擾能力較強(qiáng)的siRNA后，將siRNA轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)染無效siRNA為CON組，使用Transwell與CCK8檢測細(xì)胞遷移與增殖變化，并使用Western blotting法檢測EMT標(biāo)記物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白。結(jié)果HOXA3 mRNA在癌及癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為17.50±1.44、1.0±0.05，二者比較，P<0.05。HOXA3蛋白在癌及癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為13.42±0.18、2.57±0.04，二者比較，P<0.05。HOXA3高表達(dá)者整體生存率與轉(zhuǎn)移率均降低(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后，CON組、siRNA1組、siRNA2組HOXA3 RNA相對表達(dá)量分別為1.0±0.12、0.62±0.01、0.16±0.03，三組比較，P均<0.05。CON組、siRNA2組遷移細(xì)胞數(shù)量分別為40.57±1.68、18.33±1.01，兩組比較，P<0.05；與CON組比較，siRNA2組增殖能力減弱，P<0.05。與CON組比較，siRNA2組E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Vimentin、N-cadherin、Snail蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)。結(jié)論HOXA3在乳腺癌患者癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)HOXA3表達(dá)可減弱乳腺癌細(xì)胞遷移與增殖，這一作用可能與EMT有關(guān)。

乳腺癌；同源盒基因3；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；細(xì)胞轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性最為常見的癌癥之一，占新發(fā)病例的23%及致死病例的14%[1]，目前來說，盡管對于乳腺癌的早期預(yù)防、對敏感基因如BRCA1的缺失進(jìn)行檢測大大提高了乳腺癌患者的5年生存時(shí)間，乳腺癌的轉(zhuǎn)移依然成為一個亟待解決的問題[2]。乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的過程，基本步驟包括癌細(xì)胞侵襲周圍組織，并通過內(nèi)滲進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)，癌細(xì)胞隨后堵塞于毛細(xì)血管中，并通過外滲進(jìn)入到遠(yuǎn)隔器官中[3]，在這一過程中，主要的3個步驟內(nèi)滲、外滲、遠(yuǎn)隔器官的生長均需癌細(xì)胞能適應(yīng)相應(yīng)的微環(huán)境，同時(shí)能通過上皮-間質(zhì)(EMT)、間質(zhì)-上皮(MET)轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)侵襲與增殖能力的增加，EMT指細(xì)胞具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的過程，EMT后的類間質(zhì)細(xì)胞侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)侵入性偽足形成增多，使得細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解能力增強(qiáng)形成[4]，因此EMT過程亦被視為乳腺癌、卵巢癌等癌癥細(xì)胞侵襲的重要環(huán)節(jié)，因此尋找EMT中的關(guān)鍵蛋白，并開發(fā)特異的抑制劑，從而達(dá)到靶向治療的效果已成為研究熱點(diǎn)。同源盒(HOX)基因是一類高度保守并在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用的蛋白，HOX基因共有39種，分為A、B、C、D四類，HOX的主要功能為調(diào)控細(xì)胞分裂、黏附、增殖與分化[5]，HOX基因的異常表達(dá)已在多種腫瘤中如前列腺癌[6]、結(jié)腸癌[7]、肺癌[8]等癌癥中得到證實(shí)，在乳腺癌中，HOXA5、HOXA9與p53、BRCA1的調(diào)節(jié)相關(guān)[9]，而HOXA1則與乳腺癌細(xì)胞的遷移、他莫昔芬治療抵抗相關(guān)[10]，而HOXA3在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及作用則尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 30例人乳腺癌樣本及其相應(yīng)癌旁組織來自連云港市第二人民醫(yī)院，樣本收集過程得到連云港市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，siRNA由美國Invitrogen公司合成，脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒與Takara SYBR Premix Ex Taq檢測試劑盒購自大連寶生生物公司(Takara)，Transwell小室購自美國Corning公司，HOXA3一抗購自美國Abcam公司，EMT標(biāo)記物Snail、N-cadherin、Vimentin、 E-cadherin一抗購自美國Cell Signal Technology公司，二抗均購自北京中杉金橋公司，CCK8試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2孵箱中，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS，將細(xì)胞分為CON、siRNA1、siRNA2組，分別使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染無效siRNA、siRNA1、siRNA2小干擾RNA，CON序列為5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3′ ，siRNA1序列為GCATCTTGGCTGTCTGCTAAA，siRNA2序列為GTGTCAAACCCCTGTCAGAGT，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟根據(jù)Invitrogen公司說明書進(jìn)行。

1.3 HOXA3 mRNA表達(dá)檢測 采用Q-RT-PCR法。細(xì)胞總RNA提取使用酚-氯仿抽提法。細(xì)胞使用TRIzol裂解后，加入0.5倍體積氯仿，劇烈震蕩后15 000 r/min、離心15 min，取上清。加入等體積異丙醇，冰上沉淀20 min后，12 000 r/min離心10 min，取沉淀。沉淀用75%乙醇洗2次，即得到細(xì)胞總RNA。細(xì)胞總RNA隨后使用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作步驟根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，cDNA使用Takara SYBR Premix Ex Taq檢測試劑盒檢測，HOXA3引物序列： 5′-TGCTTTGTGTTTTGTCGAGACTC-3′，5′-CAACCCTACCCCTGCCAAC-3′，內(nèi)參引物GAPDH：5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG-3′,5′-GGGACGACCTTCGATCTACC-3′。使用2-ΔΔCt表示HOXA3 mRNA的表達(dá)。

1.4 HOXA3蛋白表達(dá)檢測 采用免疫印跡法。細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解后，加入相應(yīng)體積的Loading buffer，煮沸10 min后，加入到聚丙烯酰胺膠中，濃縮膠80 V，電泳20 min，分離膠100 V電泳40 min，待溴酚藍(lán)跑至膠板底側(cè)時(shí)，裝配轉(zhuǎn)膜三明治，依次為黑板-濾紙-聚丙烯酰胺膠-活化的PVDF膜-濾紙-白板，濕法轉(zhuǎn)膜1 h后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng)一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，并加入HRP耦聯(lián)的二抗，以GAPDH為內(nèi)參，使用ECL發(fā)光液檢測蛋白的表達(dá)，蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)量/GAPDH表達(dá)量。

1.5 生存曲線繪制 乳腺癌患者生存曲線數(shù)據(jù)來源于TCGA公共數(shù)據(jù)庫，以患者基因表達(dá)水平的平均值分組，并使用R語言中survival 包進(jìn)行生存分析，ggplot2包繪制生存曲線。

1.6 細(xì)胞遷移數(shù)檢測 采用Transwell 小室檢測細(xì)胞遷移能力，Transwell下室加入600 μL完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)，上室加入含有1×106細(xì)胞的200 μL細(xì)胞懸液，14 h后，除去小室上方細(xì)胞，下方細(xì)胞使用結(jié)晶紫染色，顯微鏡20倍視野下對穿過小室的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

1.7 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK8法，將MCF-7 CON、siRNA2細(xì)胞鋪于96孔板中，5 000/孔，同時(shí)設(shè)立復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，加入0.1體積的CCK8試劑，避光37 ℃ 孵育 3 h后，使用酶標(biāo)儀檢測OD450，以第0 h的度數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算24、48、72 h與0 h的比值，即細(xì)胞增殖系數(shù)。在確定乳腺癌患者HOXA3高表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)后，將HOXA3 siRNA轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，48 h后使用QPCR與Western blotting法檢測HOXA3 RNA與蛋白表達(dá)。

1.8 EMT標(biāo)記物表達(dá)檢測 在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7轉(zhuǎn)染CON(CON組)與HOXA3(HOXA3組)質(zhì)粒48 h后，使用Western blotting法檢測EMT標(biāo)記物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白。

2 結(jié)果

2.1 HOXA3在乳腺癌及癌旁組織中表達(dá)比較 HOXA3 mRNA在癌及癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為17.50±1.44、1.0±0.05，二者比較，P<0.05。HOXA3 蛋白在癌及癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為13.42±0.18、2.57±0.04，二者比較，P<0.05。

2.2 HOXA3表達(dá)與預(yù)后間的關(guān)系 HOXA3高表達(dá)者總體生存率為79.35%、轉(zhuǎn)移生存率為62.38%，HOXA3低表達(dá)者總體生存率為89.63%、轉(zhuǎn)移生存率為73.26%，兩者比較，P均<0.05。

2.3 HOXA3高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7遷移和增殖的關(guān)系 48 h后CON組、siRNA1組、siRNA2組HOXA3 RNA相對表達(dá)量分別為1.0±0.12、0.62±0.01、0.16±0.03，三組比較，P均<0.05。在HOXA3蛋白水平上siRNA1、CON組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，siRNA2組降低(P<0.05)，因此僅使用siRNA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA2轉(zhuǎn)染至MCF-7 48 h后，使用Transwell檢測遷移的變化，結(jié)果顯示CON組、siRNA2組遷移細(xì)胞數(shù)分別為40.57±1.68、18.33±1.01，兩組比較，P<0.05；而在轉(zhuǎn)染48 h后使用CCK8檢測增殖能力變化，siRNA2組增殖減弱，且在48、72 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均<0.05。

2.4 EMT標(biāo)記物表達(dá)比較 與CON相比，E-cadherin表達(dá)升高，Vimentin、N-cadherin、Snail表達(dá)均降低，P均<0.05。

3 討論

乳腺癌的轉(zhuǎn)移能顯著降低患者生存率、影響患者預(yù)后，而多項(xiàng)研究均表明乳腺癌的轉(zhuǎn)移與EMT密切相關(guān)，因此尋找EMT中的關(guān)鍵基因并給予靶向治療成為研究熱點(diǎn)。HOX是一類保守的蛋白，盡管如此，HOX對于EMT的作用已有證實(shí)，在神經(jīng)性膠質(zhì)瘤中，HOXA13被證實(shí)能通過激活wnt與TGF-β通路從而促進(jìn)EMT的發(fā)生和影響患者的預(yù)后[11]，以往對乳腺癌中HOX家族的研究包括HOXA3、HOXA9、HOXB5、HOXB9等，其中HOXB5與乳腺癌細(xì)胞的EMT特性和侵襲、增殖能力密切相關(guān)[12]，HOXA3在結(jié)腸癌[13]、膠質(zhì)瘤[14]及惡性淋巴瘤中[15]已被證實(shí)表達(dá)增高且與疾病的預(yù)后相關(guān)，而HOXA3在乳腺癌中表達(dá)情況鮮有報(bào)道。

在本研究中，首先檢測30例乳腺癌患者中癌組織、癌旁組織的HOXA3表達(dá)水平，證實(shí)了HOXA3在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著升高，隨后調(diào)取TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者信息，使用平均值將患者分為HOXA3高表達(dá)與低表達(dá)組，在對患者總體生存率以及轉(zhuǎn)移率進(jìn)行生存分析后發(fā)現(xiàn)，HOXA3的高表達(dá)使得患者總體生存率、轉(zhuǎn)移生存率均降低，初步證實(shí)了HOXA3的高表達(dá)與患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在確定了HOXA3的異常表達(dá)后，構(gòu)建了HOXA3特異性的siRNA，通過QOCR、Western blotting確定HOXA3 siRNA在RNA和蛋白水平的敲低效果，結(jié)果表明siRNA2在RNA和蛋白水平均具有更好的敲低效果，因此隨后將siRNA2轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，48 h后使用Transwell與CCK8檢測細(xì)胞增殖的變化，結(jié)果表明HOXA3的抑制使得MCF-7細(xì)胞遷移能力降低、增殖受限，進(jìn)一步證實(shí)了HOXA3對于乳腺癌細(xì)胞的遷移、增殖起到重要作用，而隨后檢測EMT相關(guān)標(biāo)記物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin的變化后發(fā)現(xiàn)，E-cadherin表達(dá)升高，Snail、N-cadherin、Vimentin表達(dá)降低，表明HOXA3對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響與對EMT的作用相關(guān)，Knight等[13]研究結(jié)果表明，HOXA3在結(jié)腸癌中表達(dá)增高，與結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT特性和侵襲、增殖能力密切相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，HOXA3在乳腺癌患者癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)HOXA3可減弱乳腺癌細(xì)胞遷移、增殖，而這一作用可能與EMT有關(guān)。

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