劉 夢(mèng)， 何 月， 劉昕雯， 袁 荃

(教育部生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 前言

稀土上轉(zhuǎn)換納米材料是一種能夠吸收長(zhǎng)波長(zhǎng)光并發(fā)射出短波長(zhǎng)光的發(fā)光材料，它能連續(xù)吸收兩個(gè)或多個(gè)低能量的光子，并通過系列非線性光學(xué)過程將其轉(zhuǎn)換成一個(gè)高能量光子輻射出來[1 - 2]。稀土上轉(zhuǎn)換納米材料具有光學(xué)穩(wěn)定性好、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)控、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[3 - 5]，更重要的是其可以被近紅外光激發(fā)，能有效地抑制背景熒光的干擾，在生物分析檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[6 - 8]。然而，單純的上轉(zhuǎn)換納米材料用作檢測(cè)時(shí)對(duì)目標(biāo)物沒有選擇性，因此將其與具有特異性識(shí)別功能的分子結(jié)合是實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物高選擇性檢測(cè)的關(guān)鍵[9 - 10]。

核酸適配體是具有選擇性識(shí)別功能的單鏈DNA或RNA序列[11 - 12]，它能夠與小分子、蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞等靶標(biāo)物進(jìn)行高效、高特異性結(jié)合，被稱為“化學(xué)抗體”[13 - 15]。與抗體相比，核酸適配體具有設(shè)計(jì)靈活、易于化學(xué)合成和修飾、成本低廉、生物化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，在生物分析檢測(cè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16 - 19]。將核酸適配體與稀土上轉(zhuǎn)換納米材料相結(jié)合，能夠發(fā)展一系列靈敏、高選擇性、高效、簡(jiǎn)便的分析檢測(cè)平臺(tái)[20 - 22]。本文主要綜述了近幾年核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料在小分子、蛋白質(zhì)、核酸、病原微生物、細(xì)胞等生物分子檢測(cè)中的應(yīng)用，并展望了其在分析檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展前景。

2 核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料在生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 小分子檢測(cè)

2.1.1ATPATP是各項(xiàng)生命活動(dòng)所需能量的提供者，是生物體內(nèi)能量代謝和轉(zhuǎn)換的重要樞紐[23]，與細(xì)胞中的各種生命活動(dòng)息息相關(guān)。ATP的檢測(cè)在疾病預(yù)防與診斷、食品分析等領(lǐng)域具有重要作用[24]。目前多個(gè)研究小組利用核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的檢測(cè)。Song等[25]將上轉(zhuǎn)換納米顆粒作為供體，羧基四甲基羅丹明(TAMRA)作為受體設(shè)計(jì)了核酸適配體生物傳感器，利用供受體之間的能量共振轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的檢測(cè)，檢測(cè)限為20 μmol/L。He等[26]基于SiO2包裹的上轉(zhuǎn)換納米顆粒和兩段核酸適配體片段構(gòu)建了一種高靈敏度的共振能量轉(zhuǎn)移體系，用于ATP的檢測(cè)，檢測(cè)限為1.70 μmol/L。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，Liu[27]等采用氧化石墨烯作為能量受體，基于核酸適配體功能化上轉(zhuǎn)換納米材料和氧化石墨烯之間的能量共振轉(zhuǎn)移構(gòu)建了高靈敏度的生物傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到80 nmol/L。在這個(gè)設(shè)計(jì)中，核酸適配體與氧化石墨烯之間的吸附作用使NaYF4∶Yb,Er的上轉(zhuǎn)換發(fā)光幾乎全被猝滅，加入ATP后，核酸適配體與ATP結(jié)合從氧化石墨烯表面脫離，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，從而達(dá)到檢測(cè)ATP的目的。這些基于共振能量轉(zhuǎn)移的核酸適配體功能化上轉(zhuǎn)換納米探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的快速、高特異性、高靈敏度檢測(cè)，能夠被應(yīng)用于細(xì)胞生命活動(dòng)的研究和疾病診斷中。

2.1.2真菌毒素真菌毒素是真菌在食品或飼料中生長(zhǎng)所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)人和動(dòng)物都有極大的危害[28]。直接或間接方式攝入真菌毒素會(huì)產(chǎn)生急慢性中毒、致癌性等危害，若長(zhǎng)期被人們攝入，具有潛在的致肝癌、胃癌、腎癌等的可能性[29]。江南大學(xué)王周平教授課題組開展了一系列利用核酸適配體修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒檢測(cè)毒素物質(zhì)的研究工作，拓展了上轉(zhuǎn)換納米材料在分析檢測(cè)中的應(yīng)用。該課題組利用上轉(zhuǎn)換納米顆粒與納米金之間的共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了伏馬菌毒素B1(FB1)的檢測(cè)[30]。他們將上轉(zhuǎn)換納米顆粒修飾在分子信標(biāo)一端，納米金修飾在分子信標(biāo)的另一端導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換發(fā)光猝滅，當(dāng)存在待測(cè)物時(shí)上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)FB1的檢測(cè)。此外，該課題組還通過雙色上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒-氧化石墨烯共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了FB1和赭曲霉毒素A(OTA)的同時(shí)檢測(cè)[31]。具體設(shè)計(jì)是將FB1和OTA的核酸適配體分別與兩種上轉(zhuǎn)換納米顆粒連接作為供體探針，該探針通過非共價(jià)鍵與氧化石墨烯相連，上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅，當(dāng)加入靶標(biāo)物FB1和OTA后，上轉(zhuǎn)換探針與靶標(biāo)物結(jié)合，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種毒素的同時(shí)檢測(cè)。將核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料用于真菌毒素的檢測(cè)，拓展了上轉(zhuǎn)換納米材料在食品分析、環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用，對(duì)解決食品安全和環(huán)境污染問題起到了一定的推動(dòng)作用。

2.1.3激素激素是一類由高度分化的內(nèi)分泌細(xì)胞合成并直接分泌入血的化學(xué)信息物質(zhì)，它通過調(diào)節(jié)各種組織的代謝活動(dòng)影響人體的生理活動(dòng)[32 - 33]。Guo等[34]構(gòu)建了基于上轉(zhuǎn)換納米材料和核酸適配體的電致化學(xué)發(fā)光適配體傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境雌激素雙酚A的檢測(cè)。此外，多種激素的同時(shí)檢測(cè)也非常重要。雌二醇和孕酮是一類重要的雌性類固醇激素，兩者的濃度及比值可以用來進(jìn)行先兆流產(chǎn)、異位妊娠等疾病的評(píng)估?；诖耍覀冋n題組設(shè)計(jì)合成了核酸適配體功能化的上轉(zhuǎn)換納米探針，結(jié)合光子晶體基底，構(gòu)建了對(duì)雌二醇及孕酮兩種激素同時(shí)檢測(cè)的集成性微器件。除了雙酚A、雌二醇和孕酮等激素之外，諸多其他的激素也在生物體中發(fā)揮了不可替代的功能，核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料也將為其他激素的檢測(cè)提供一種高靈敏、高特異性的傳感平臺(tái)。

2.2蛋白質(zhì)檢測(cè)

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要載體，是生物功能的主要執(zhí)行者[35]。蛋白質(zhì)的檢測(cè)對(duì)生命科學(xué)研究具有重大意義[36]。劉志洪教授課題組[37]首次利用核酸適配體修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料和碳納米顆粒之間的共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了人血漿中凝血酶的檢測(cè)。該小組利用共價(jià)作用將核酸適配體修飾在上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面，當(dāng)無靶標(biāo)物凝血酶存在時(shí)，上轉(zhuǎn)換納米顆粒與碳球通過π-π相互作用靠近，上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅；靶標(biāo)物存在時(shí)，適配體與靶標(biāo)物結(jié)合，上轉(zhuǎn)換納米顆粒與碳球的距離增大，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的檢測(cè)。此外，該課題組還利用上轉(zhuǎn)換納米材料和碳納米顆粒之間的共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌胚抗原和免疫球蛋白的檢測(cè)。除了以碳納米顆粒作為受體，Chen等[38]將金納米棒作為受體，上轉(zhuǎn)換納米材料作為供體，構(gòu)建了用于凝血酶檢測(cè)的共振能量轉(zhuǎn)移體系。Lin等[39]基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒和金納米棒之間的共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)了對(duì)血清中血小板源生長(zhǎng)因子的檢測(cè)。相較于溶液體系中蛋白質(zhì)的檢測(cè)，基底上蛋白質(zhì)的檢測(cè)時(shí)基底容易受到背景熒光的干擾，從而影響檢測(cè)靈敏度。為了解決這一問題，我們課題組[40]開發(fā)了基底上潛指紋中溶菌酶的檢測(cè)方法，將氨基修飾的溶菌酶核酸適配體修飾到上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面，構(gòu)建了高特異性和無背景熒光干擾的指紋中溶菌酶檢測(cè)探針。由于基底中的熒光物質(zhì)不能被近紅外光激發(fā)，故該探針能有效消除背景熒光的干擾。此外，通過改變核酸適配體的種類，該探針還適用于指紋中其它標(biāo)志物的檢測(cè)。我們開發(fā)的方法有效解決了傳統(tǒng)指紋中標(biāo)志物檢測(cè)方法所面臨的特異性差和易受背景熒光干擾這兩方面的問題，有望在醫(yī)療診斷、刑事偵查等領(lǐng)域得到更進(jìn)一步的應(yīng)用。

2.3 核酸檢測(cè)

核酸是生命的最基本物質(zhì)之一，廣泛存在于所有動(dòng)植物細(xì)胞、微生物體內(nèi)，既是生物的基本遺傳物質(zhì)，也是基因表達(dá)的基礎(chǔ)[41]。核酸分子與生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病、衰老等活動(dòng)息息相關(guān)，其檢測(cè)對(duì)多種疾病的診斷、基因治療、藥物篩選等領(lǐng)域有著非常重要的意義[42]。Cristobal等[43]基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒和氧化石墨烯的共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建了高靈敏度的DNA傳感器。在該設(shè)計(jì)中，上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面的單鏈DNA可以與氧化石墨烯結(jié)合使得上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅，當(dāng)靶標(biāo)DNA存在時(shí)，上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面的DNA單鏈與靶標(biāo)物雜交形成雙鏈，氧化石墨烯與上轉(zhuǎn)換顆粒分離，上轉(zhuǎn)換的發(fā)光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的檢測(cè)。Laurenti等[44]基于石墨烯量子點(diǎn)和單鏈DNA修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒構(gòu)建了特定miRNA序列的檢測(cè)平臺(tái)。無目標(biāo)miRNA序列時(shí)，單鏈DNA修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒與石墨烯量子點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)了上轉(zhuǎn)換發(fā)光；目標(biāo)miRNA序列存在時(shí)，其與單鏈DNA雜交形成雙鏈DNA，阻礙了上轉(zhuǎn)換納米顆粒和石墨烯量子點(diǎn)的結(jié)合，上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)度降低，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)miRNA序列的檢測(cè)，檢測(cè)限低至10 fmol/L。我們課題組[45]基于不同激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料構(gòu)建了可以同時(shí)檢測(cè)多種疾病相關(guān)mRNA的可視化檢測(cè)平臺(tái)。我們將靶向兩種mRNA的上轉(zhuǎn)換納米探針負(fù)載在光子晶體基底上，利用上轉(zhuǎn)換顆粒表面DNA分子與氧化石墨烯的結(jié)合作用猝滅上轉(zhuǎn)換納米探針的發(fā)光。在靶標(biāo)mRNA存在條件下，相應(yīng)的上轉(zhuǎn)換納米探針表面的DNA分子與mRNA雜交形成雙鏈，探針與氧化石墨烯分離，上轉(zhuǎn)換發(fā)光得到恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種疾病相關(guān)mRNA的同時(shí)檢測(cè)，該工作對(duì)癌癥早期的診斷以及生命科學(xué)具有重要意義。

2.4 病原微生物檢測(cè)

病原微生物是一類能引起人類和動(dòng)植物病害的微生物[46]，它會(huì)引起感染甚至傳染病，對(duì)人類和動(dòng)植物的健康造成極大的危害，開發(fā)快速、靈敏、成本低的病原微生物檢測(cè)方法對(duì)人類健康至關(guān)重要[47]。Jin等[48]基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒和金納米棒之間的共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建了檢測(cè)大腸桿菌的適體傳感器，無靶標(biāo)物時(shí)，上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面的DNA單鏈與金納米棒表面的核酸適配體雜交，上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅，加入靶標(biāo)物后，核酸適配體與靶標(biāo)物結(jié)合，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。王周平教授課題組[49]首次展開了多色上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒同時(shí)標(biāo)記檢測(cè)多組分毒素物質(zhì)的研究，利用雙色上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記-磁分離適配體識(shí)別技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的同時(shí)檢測(cè)。該設(shè)計(jì)中將上轉(zhuǎn)換納米材料標(biāo)記的適配體作為顯示探針，適配體功能化的磁性材料作為捕獲探針，構(gòu)建了一種“三明治”夾心型同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的新方法。此外，該課題組還建立了利用雙色上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記-磁分離技術(shù)同時(shí)檢測(cè)兩種手足口病病毒的方法[50]，將兩種上轉(zhuǎn)換納米顆粒與特定核酸序列連接構(gòu)成信號(hào)探針，同時(shí)將磁性納米顆粒分別與特定核酸序列連接構(gòu)成捕獲探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)手足口病病毒EV-71和CV-A16的同時(shí)檢測(cè)。病原微生物具有種類繁多、遺傳變異快等特點(diǎn)，與操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，利用核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒檢測(cè)病原微生物具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。

2.5 細(xì)胞檢測(cè)

細(xì)胞是構(gòu)成生物體的基本結(jié)構(gòu)單元，同時(shí)也是疾病形成過程中致病的基本單元[51]。細(xì)胞的分析檢測(cè)對(duì)于生物工程、疾病診斷具有重要意義[52]。劉莊教授課題組[53]首次提出了將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與核酸適配體結(jié)合作為納米探針檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs(CCRF-CEM細(xì)胞)，并且利用磁性納米材料將檢測(cè)到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了有效分離。他們首先在上轉(zhuǎn)換納米材料表面修飾了PEG-PMHC18后，再結(jié)合上生物素和核酸適配體，形成能特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的共聚物，進(jìn)一步利用生物素和親和素的特異性結(jié)合，加入修飾親和素的超順磁Fe3O4，最后用磁鐵分離出循環(huán)腫瘤細(xì)胞。Wang等[54]基于稀土上轉(zhuǎn)換納米材料和核酸適配體構(gòu)建了一個(gè)近紅外光驅(qū)動(dòng)的光電適配體傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的檢測(cè)。將核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒用于癌細(xì)胞的檢測(cè)，是一種有潛力的、具有高特異性和高靈敏度、簡(jiǎn)便可行的方法，對(duì)未來腫瘤臨床診斷具有重大的意義。

3 展望

近年來，核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料在生物檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，表現(xiàn)出靈敏度高、選擇性好、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)勢(shì)，然而還存在一些問題有待解決：

(1)稀土上轉(zhuǎn)換納米材料的發(fā)光效率低，并且隨著顆粒尺寸減小，發(fā)光效率降低，限制了其在分析檢測(cè)以及熒光成像等方面的應(yīng)用。

(2)為了提高稀土上轉(zhuǎn)換納米材料水溶液體系中的分散性，擴(kuò)展其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)顆粒表面進(jìn)行修飾是非常必要的，目前常用的表面修飾方法有表面配體交換法、包裹法等，在顆粒表面修飾一層或多層官能基團(tuán)，使得修飾后的納米顆粒具有親水/疏水性或便于連接DNA、抗體/抗原等以實(shí)現(xiàn)特殊的生物功能。然而目前要實(shí)現(xiàn)在顆粒表面定量可控地修飾配體仍比較困難。此外，通過在上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面修飾多種配體以實(shí)現(xiàn)材料的多功能化仍然存在著很大挑戰(zhàn)。

(3)目前用于構(gòu)建適配體傳感器的核酸適配體種類仍十分有限，大部分研究工作都限制于一些常見的核酸適配體，這限制了其在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著SELEX等生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多種類的核酸適配體將被篩選出來，大大促進(jìn)其在生物傳感領(lǐng)域的發(fā)展。

隨著這些問題的解決和完善，核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料將會(huì)進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度、擴(kuò)展更寬的檢測(cè)對(duì)象范圍，在生物分析領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)更加廣泛、深入的應(yīng)用。