宋榮斌， 朱俊杰

(生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 210023)

1 前言

生物傳感器是由分子識(shí)別元件與信號(hào)轉(zhuǎn)換元件構(gòu)成的分析檢測器件，已經(jīng)成功應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、疾病診斷、食品安全和軍事等領(lǐng)域[1 - 2]。目前，對于生物傳感器不僅要求準(zhǔn)確、可靠、靈敏的檢測目標(biāo)物，還逐步傾向于能夠快速便捷式的現(xiàn)場檢測[3 - 5]。目前絕大多數(shù)的生物傳感器離不開外加能源，這大大制約了其發(fā)展和廣泛應(yīng)用[6]。酶型生物燃料電池(BFC)是一類以生物酶為催化劑，直接將燃料中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的裝置。在酶的催化作用下，糖類、醇類或胺類等燃料在陽極發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生電子，這些電子流經(jīng)外部負(fù)載到達(dá)陰極，在陰極上經(jīng)酶的催化作用被氧化性物質(zhì)(氧氣)接受，產(chǎn)生電流[7 - 9]。酶生物燃料電池的反應(yīng)條件溫和(常溫、常壓、中性pH)，燃料來源廣泛并在自然條件下可再生，生物催化劑和燃料的生物相容性好，能夠避免對目標(biāo)分析物造成損傷；同時(shí)，它還具有能量轉(zhuǎn)化效率高、裝置易微型化等優(yōu)點(diǎn)[10 - 12]。因此，酶生物燃料電池給生物傳感器的發(fā)展帶來了新機(jī)遇。

基于酶生物燃料電池的自供能生物傳感器其基本的檢測思路是將目標(biāo)分析物的濃度轉(zhuǎn)換為生物燃料電池的電壓、電流和功率變化[13 - 15]。它與傳統(tǒng)生物傳感器相比優(yōu)勢在于：(1)無需外部電源，只需用電壓電流表這樣的簡單手段測量BFC本身的輸出信號(hào)，從而便于實(shí)現(xiàn)快速的現(xiàn)場實(shí)時(shí)監(jiān)測[16]。(2)無需三電極體系，電化學(xué)傳感發(fā)生在微生物燃料電池本身的陰陽兩極，更利于微型化。另外，也無需參比電極，自供能傳感器的工作穩(wěn)定性好[15,17]。(3)生物燃料電池的自供能生物傳感器的測試過程未引入外加電源，可有效防止體系中其它電化學(xué)活性物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)所帶來的干擾[18]。從目前酶生物燃料電池自供能傳感器的相關(guān)報(bào)道來看，這類傳感器的基本工作原理主要有底物效應(yīng)、酶活抑制效應(yīng)、酶負(fù)載量變化和位阻效應(yīng)四大類。本文以此為分類，就近五年內(nèi)酶生物燃料電池自供能傳感器的發(fā)展進(jìn)行詳細(xì)的論述。

2 酶生物燃料電池自供能傳感器研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

2.1 底物效應(yīng)

酶生物燃料電池的輸出性能與燃料的濃度呈現(xiàn)依賴關(guān)系。由于它所使用的燃料為兩極固定的酶對應(yīng)的底物，因此可以通過電池性能參數(shù)的變化來反映生物底物濃度的變化。借助這一構(gòu)建思路，研究人員發(fā)展了多種基于底物效應(yīng)的酶生物燃料電池自供能生物傳感器。其中，以檢測葡萄糖的酶生物燃料電池自供能傳感器最為常見。2001年，Katz等[19]最早將葡萄糖氧化酶(GOD)的活性中心黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，以及葡萄糖脫氫酶(GDH)的活性中心煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)固定到陽極上，將細(xì)胞色素C氧化酶固定到陰極上，構(gòu)建了葡萄糖/氧氣EBFC。該電池的開路電位與葡萄糖濃度存在依賴性關(guān)系，可用作檢測葡萄糖的自供能傳感器。這一研究開創(chuàng)了酶生物燃料電池檢測葡萄糖的先河。在此工作的基礎(chǔ)上，Seokheum等[20]利用打印技術(shù)，在紙上發(fā)展了自供能式葡萄糖傳感器，大大的提高了傳感器的便捷性。另外，不同于前期工作，這項(xiàng)工作中酶生物燃料電池采用的是鎳基空氣陰極，避免了使用酶，進(jìn)一步降低了傳感器的成本，進(jìn)而提高了其實(shí)用性。作為自供能傳感器的能量供給和信號(hào)響應(yīng)元件，高效、穩(wěn)定的生物燃料電池是構(gòu)建靈敏度高、檢測范圍寬的傳感器的基礎(chǔ)。因此，Zhang等[21]將光電技術(shù)引入到了自供能式葡萄糖傳感器。他們利用氫氧化鎳/硫化鎘/二氧化鈦光電陽極和血紅素/石墨烯修飾的陰極組建光燃料電池。研究表明，在光照的條件下，葡萄糖的氧化得到進(jìn)一步促進(jìn)，因此構(gòu)建的光燃料電池的性能有很大提升，開路電壓達(dá)到了1.21 V。受益于這一優(yōu)良的性能，構(gòu)建的葡萄糖傳感器的線性檢測范圍為10～500 μmol/L，檢測限低至5.3 μmol/L。這項(xiàng)工作的成功開展將對在酶生物燃料電池自供能傳感器中獲得多重能量轉(zhuǎn)移帶來啟發(fā)，有望獲得超靈敏的自供能式傳感器。

通過對酶的選擇和替換，可以發(fā)展用于檢測其它底物的自供能式傳感器。Minteer等[22]將乳酸氧化酶用作陽極生物催化劑構(gòu)建酶生物燃料電池。同樣地，基于電池輸出電流與底物乳酸濃度之間的依賴關(guān)系，開發(fā)的酶生物燃料電池可以用于分析檢測乳酸。隨后，Wang等[23]借助絲網(wǎng)印刷技術(shù)在具有高度伸縮性的紡織物上構(gòu)建了乳酸自供能式傳感器。這一傳感器可以抵抗嚴(yán)重的形變，即使在100次拉伸后，性能也未受影響。因此，該團(tuán)隊(duì)將其直接構(gòu)建在襪子上用于直接分析人體汗液中的乳酸含量。很顯然，該工作有助于推動(dòng)可穿戴式自供能傳感器的發(fā)展。另外，在酶生物燃料電池陰極，氧氣作為電子受體，它的濃度也直接影響到電池的性能。因此，基于電池輸出性能和氧氣中的依賴關(guān)系，也可以發(fā)展檢測氧氣的自供能式傳感器[24]。上述工作都是發(fā)展分析酶直接底物的自供能式傳感器，對它們的工作原理進(jìn)一步深入，即可以開發(fā)底物氧化產(chǎn)物的傳感器。Dong等[25]利用乙醇脫氫酶(ADH)和膽紅素氧化酶(BOD)分別作為陽極和陰極生物催化劑，發(fā)展了可用于檢測乙醛的自供能傳感器。在這一工作中，燃料是乙醇，ADH催化氧化乙醇產(chǎn)生乙醛并獲得電子。當(dāng)存在目標(biāo)物乙醛時(shí)，陽極的催化反應(yīng)平衡向左側(cè)移動(dòng)，產(chǎn)生的電子減少，酶生物燃料電池性能降低。因此，酶生物燃料電池的性能與乙醛之間也存在著某種依賴關(guān)系，可用于定量分析乙醛。這為拓寬基于底物效應(yīng)的酶生物燃料電池自供能傳感器的檢測范圍提供了新思路。

2.2 酶活抑制效應(yīng)

在酶生物燃料電池中，生物催化劑酶的活性必然會(huì)影響電池的性能。當(dāng)檢測的目標(biāo)物影響酶的活性時(shí)，會(huì)引發(fā)酶生物燃料電池各性能參數(shù)的變化，這些參數(shù)的變化程度就可以反映出目標(biāo)物的濃度，進(jìn)而可以發(fā)展基于酶活抑制效應(yīng)的酶生物燃料電池自供能傳感器。早在2011年，Dong等[26]基于Hg2+對乙醇脫氫酶和膽紅素氧化酶活性的抑制作用，發(fā)展了Hg2+的酶生物燃料電池自供能傳感器，并將其用于分析實(shí)際水樣(自來水、地下水和湖水等)中Hg2+的含量。結(jié)果表明，該傳感器具有優(yōu)良的選擇性，其它15中常見金屬離子均無干擾；線性檢測范圍為1～500 nmol/L，檢測限為1 nmol/L，遠(yuǎn)低于其它報(bào)道的方法。除了膽紅素氧化酶外，漆酶也是酶生物燃料電池中常用的陰極酶。Minteer等[27]發(fā)現(xiàn)亞砷酸鹽和砷酸鹽均對漆酶的活性表現(xiàn)出抑制作用?；谶@一原理，該課題組將葡萄糖氧化酶和漆酶分別用作酶生物燃料電池的陽極和陰極生物催化劑，發(fā)展了亞砷酸和砷酸鹽的自供能傳感器。同樣地，基于全氟辛烷磺?；衔飳劝彼崦摎涿富钚缘囊种谱饔?，Xie等[28]開發(fā)了用于檢測這種有機(jī)污染物的酶生物燃料電池自供能傳感器。上述工作中，目標(biāo)物所引起的電池性能的變化只需萬用表即可測定，這為環(huán)境污染領(lǐng)域的便捷式、現(xiàn)場檢測提供了新策略。

除了直接檢測酶的抑制劑外，酶生物燃料電池自供能傳感器還被用于分析酶抑制劑的掩蔽劑。Liu等[29]利用葡萄糖氧化酶和漆酶分別作為陽極和陰極的生物催化劑構(gòu)建酶生物燃料電池，并用作L-半胱氨酸的自供能式檢測。在該工作中，Cu2+會(huì)與葡萄糖氧化酶活性中心還原態(tài)的輔酶FADH2形成絡(luò)合作用，從而抑制酶的活性，進(jìn)而獲得較低的輸出性能。而當(dāng)加入L-半胱氨酸后，通過Cu-S鍵的作用大量的Cu2+會(huì)與L-半胱氨酸結(jié)合，即酶重新被激活，電池的輸出性能重新恢復(fù)，性能恢復(fù)的程度與L-半胱氨酸的濃度呈依賴關(guān)系。相似的原理也被用于開發(fā)EDTA的酶生物燃料電池自供能傳感器[30]。不同于酶抑制劑的檢測報(bào)道，這兩項(xiàng)檢測掩蔽劑的傳感器屬于“signal-on”模式，因此可以避免假陽性信號(hào)的出現(xiàn)，能夠更準(zhǔn)確的反應(yīng)檢測物的實(shí)際濃度變化。另外，同一種酶抑制劑對應(yīng)的掩蔽劑種類往往很多，通過合理的設(shè)計(jì)，可以進(jìn)一步拓寬自供能傳感器可檢測的范圍。

2.3 酶負(fù)載量變化

酶生物燃料電池電極上酶負(fù)載量的變化勢必會(huì)影響電池的性能。通過合理的設(shè)計(jì)，使得分析物濃度與電極上酶的負(fù)載量存在依賴關(guān)系，從而表現(xiàn)出電池性能的變化，這些變化反過來反映了目標(biāo)分析物的濃度。借助這一理念，并結(jié)合免疫技術(shù)，Ge等[31]制備了一種用于檢測腫瘤標(biāo)志物的紙質(zhì)自供能傳感器。在該工作中，電極陽極修飾上抗體1用于捕獲癌胚抗原，同時(shí)將抗體2與葡萄糖脫氫酶一同修飾在多壁碳納米管上。當(dāng)存在癌胚抗原時(shí)，抗體1、抗原及抗體2之間形成夾心結(jié)構(gòu)，因而葡萄糖脫氫酶也同時(shí)固定到陽極表面。因此，電池的輸出電流與癌胚抗原的濃度之間存在依賴性關(guān)系。相似的報(bào)道也見于Guo等[32]的工作，該傳感器的檢測限低至0.2 nmol/L，靈敏度比傳統(tǒng)的ELISA法提高了50倍。DNA互補(bǔ)技術(shù)也被用于酶生物燃料電池自供能傳感器領(lǐng)域。Yu等[33]在酶生物燃料電池的陽極修飾上與目標(biāo)DNA部分互補(bǔ)的DNA1，同時(shí)將葡萄糖氧化酶裝載到多孔金內(nèi)，并在多孔金表面通過Au-S鍵修飾上與目標(biāo)DNA部分互補(bǔ)的DNA2。當(dāng)溶液中存在目標(biāo)DNA時(shí)，基于DNA雙鏈互補(bǔ)技術(shù)，葡萄糖氧化酶被固定到陽極上。同樣電池的性能提高程度與目標(biāo)DNA的濃度呈現(xiàn)依賴關(guān)系。另外，該工作中還引入了超級(jí)電容器用于存儲(chǔ)酶生物燃料電池產(chǎn)生的電能。這些產(chǎn)生的電能被大量累計(jì)，并被瞬間釋放，因此整個(gè)體系可以獲得更大的電流，進(jìn)而可以提高傳感器的靈敏度，為檢測DNA錯(cuò)配提供了新途徑。

在上述工作的基礎(chǔ)上，我們課題組[34]基于免疫競爭法構(gòu)建了用于檢測腫瘤細(xì)胞的酶自供能傳感器。在該工作中，陽極修飾上能夠捕獲腫瘤細(xì)胞的適配體，該適配體同時(shí)也是一段DNA序列。因此我們將與其部分互補(bǔ)的DNA序列和膽紅素氧化酶一同修飾在DNA上?；贒NA互補(bǔ)技術(shù)，陽極表面固定上大量的膽紅素氧化酶。當(dāng)存在腫瘤細(xì)胞時(shí)，發(fā)生免疫競爭反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞與陽極的適配體結(jié)合，同時(shí)互補(bǔ)的雙鏈DNA被打破，膽紅素氧化酶從陽極脫離，電池輸出性能的降低程度與腫瘤細(xì)胞的濃度存在依賴關(guān)系。這項(xiàng)工作相當(dāng)于在前面的工作原理上更進(jìn)了一步，目標(biāo)物的作用不再是輔助生物催化劑的固定，而是促進(jìn)生物催化劑從電極表面的脫離。研究結(jié)果表明，該傳感器的檢測限為2個(gè)細(xì)胞，有望成為臨床腫瘤早期診斷的有力工具。最近，分子印跡技術(shù)也被用于酶生物燃料電池自供能傳感器。Liu等[35]在酶燃料電池的陰極構(gòu)建了硼酸鹽親和性的分子印跡聚合物，當(dāng)目標(biāo)物糖蛋白存在時(shí)，分子印跡聚合物識(shí)別目標(biāo)物，并且通過親和作用固定上硼酸親和基團(tuán)功能化的碳納米管/膽紅素氧化酶。因此，酶生物燃料電池性能的提高反映了不同濃度的目標(biāo)物。開發(fā)的自供能傳感器可以用于直接分析血清樣品，表現(xiàn)出了很好的臨床實(shí)用性。

2.4 位阻效應(yīng)

酶生物燃料電池的性能容易受到電極與酶之間電子傳遞效率以及酶催化底物速率的影響。當(dāng)不同濃度的目標(biāo)物被捕獲到電極上時(shí)，會(huì)對酶與底物的接觸和電極與酶之間的電子傳遞產(chǎn)生不同的阻礙作用或是去阻礙作用，進(jìn)而不同程度的影響電池的性能?；谶@一原理，Yu等[36]發(fā)展了一種檢測前列腺特異性抗原的自供能傳感器。在該工作中，Cu2O用作陽極催化劑，膽紅素氧化酶作為陰極催化劑。當(dāng)陽極上固定的抗體與目標(biāo)抗原蛋白結(jié)合后，抗原蛋白會(huì)充當(dāng)絕緣層阻礙燃料與陽極催化劑的接觸，進(jìn)而使得酶生物燃料電池的性能降低。利用相似的原理，我們課題組[37]也開發(fā)了一種用于檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的工作。在電池的陰極修飾上腫瘤細(xì)胞的適配體，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞存在時(shí)，適配體捕獲細(xì)胞，細(xì)胞固定到電極上。因此，基于位阻作用，電子受體K3[Fe(CN)6]與陰極的接觸受到阻礙；同時(shí)，細(xì)胞帶負(fù)電會(huì)靜電排斥電子受體K3[Fe(CN)6]，電子受體與陰極的接觸會(huì)被進(jìn)一步削弱。該工作展現(xiàn)出了更高的靈敏度。另外，在加熱的條件下(48 ℃)，被適配體捕獲的細(xì)胞會(huì)重新從陰極表面脫落，因此該傳感器可以重復(fù)使用。研究結(jié)果表明可重復(fù)使用9次，進(jìn)一步提高了該傳感器的實(shí)用性。

多目標(biāo)分析是傳感器的目標(biāo)之一，Dong等[38]開發(fā)了一種基于位阻效應(yīng)的自供能適配體邏輯門傳感器。該工作構(gòu)建了基于葡萄糖氧化酶/凝血酶適配體功能化的生物陽極和膽紅素氧化酶/溶菌酶適配體功能化的生物陰極的無隔膜微流控芯片酶生物燃料電池。當(dāng)只有凝血酶存在時(shí)即輸入信號(hào)為(1,0)時(shí)，陽極的TBA層識(shí)別凝血酶，封閉電極界面，導(dǎo)致葡萄糖在電極表面發(fā)生氧化的過電位增加，因此(1,0)信號(hào)的輸入降低了EBFC開路電壓；反之，溶菌酶單獨(dú)存在時(shí)，即輸入信號(hào)為(0,1)時(shí)，會(huì)被陰極適配體捕獲，導(dǎo)致氧氣還原過電位的增加，電池性能降低。當(dāng)兩種目標(biāo)物同時(shí)存在，即輸入信號(hào)為(1,1)時(shí)，陰陽兩極的適配體均捕獲底物，電壓的輸出信號(hào)進(jìn)一步降低，即此時(shí)的輸出信號(hào)記為輸出0。當(dāng)沒有底物輸入時(shí)，電池的電壓輸出幾乎不會(huì)受到影響記為輸出1，這與邏輯門計(jì)算中的NAND邏輯門原理相似。因此，該傳感器可以用于檢測樣品中兩種目標(biāo)物是否同時(shí)存在，但無法確定哪一種目標(biāo)物存在，還需進(jìn)一步提高。上述所有工作中，目標(biāo)物都是起到阻礙作用，因此這些傳感器都是“signal-off”的模式。在這些工作原理上再進(jìn)一步，即可開發(fā)“signal-on”模式的自供能傳感器。Li等[39]開發(fā)了一種檢測氨芐青霉素的自供能傳感器。在該工作中，酶生物燃料電池的陽極修飾上葡萄糖氧化酶和適配體1(也是一段DNA序列)；同時(shí)在二氧化硅/納米金復(fù)合材料的表面修飾上適配體1的互補(bǔ)DNA序列?；贒NA互補(bǔ)技術(shù)，二氧化硅/納米金復(fù)合材料固定到電極表面，充當(dāng)絕緣層阻礙葡萄糖與酶的接觸。當(dāng)存在目標(biāo)物時(shí)，由于免疫競爭反應(yīng)，適配體1與目標(biāo)物結(jié)合，同時(shí)二氧化硅/納米金復(fù)合材料從電極表面脫落，位阻減小，電池的性能恢復(fù)。電池性能提高的程度即可以反應(yīng)目標(biāo)物的濃度,有望成為食品安全現(xiàn)場檢測的有力手段。

3 結(jié)論和展望

酶生物燃料電池自供能傳感器在推動(dòng)傳感器便捷化、微型化和低成本化等方面具有突出的優(yōu)勢，受到了廣泛的關(guān)注。本綜述從設(shè)計(jì)原理出發(fā)，詳細(xì)的介紹了近五年酶生物燃料電池自供能傳感器的研究狀況和應(yīng)用領(lǐng)域。目前，通過借助免疫技術(shù)、DNA技術(shù)、適配體技術(shù)、分子印跡技術(shù)等，酶生物燃料電池自供能傳感器已經(jīng)應(yīng)用于酶、蛋白、細(xì)胞、生物標(biāo)志物以及環(huán)境污染物的檢測，大大簡化了檢測工序。同時(shí)，也仍然存在著一些問題，此類自供能傳感器通常是體外檢測，如何通過合理的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)原位檢測，將有助于避免生物分子脫離人體所造成的關(guān)鍵信息缺失。另一方面，傳感器識(shí)別元件只依賴于某一個(gè)電極，有效的同時(shí)利用雙電極有望實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的分析和靈敏度的提高。此外，酶生物燃料電池較低的性能，也限制了此類自供能傳感器的靈敏度和實(shí)際應(yīng)用，研究者可通過開發(fā)結(jié)構(gòu)更為合理的基底材料或引入其他能源(如太陽能)來完善這一問題。因此，原位、多目標(biāo)、超靈敏檢測將是未來酶生物燃料電池自供能傳感器的重要研究方向之一。