殷述亭， 劉寶良， 黃 濱， 霍歡歡， 王蔚周 順

(1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266109；2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071)

擁擠脅迫對(duì)已接種疫苗的大菱鲆部分免疫和應(yīng)激指標(biāo)的影響

(1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266109；2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071)

通過(guò)對(duì)3個(gè)養(yǎng)殖初始密度(低、中、高密度組分別為5、10、20 kg/m2)的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)接種減毒遲緩愛(ài)德華氏菌疫苗，觀察其血液、脾臟、頭腎、鰓和皮膚中部分免疫和應(yīng)激指標(biāo)的變化規(guī)律，研究經(jīng)接種疫苗操作后大菱鲆應(yīng)對(duì)擁擠脅迫的應(yīng)激響應(yīng)。結(jié)果顯示，低密度養(yǎng)殖的白細(xì)胞介素(1L-1β)、補(bǔ)體(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)和腫瘤壞死因子(TNF -α)等免疫指標(biāo)顯著高于中、高密度組(P<0.05)，高密度組血液中皮質(zhì)醇的含量高于中、低密度組(P<0.05)；通過(guò)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，高密度組的熱休克蛋白(HSP70)表達(dá)量顯著高于中、低密度組；低密度組的免疫球蛋白M(IGM)表達(dá)量高于中、高密度組。研究表明，為提高大菱鲆的免疫效果、減少應(yīng)激反應(yīng)，可以采用低密度(5 kg/m2)養(yǎng)殖。

大菱鲆；遲緩愛(ài)德華氏菌疫苗；擁擠脅迫；血清指標(biāo)；基因表達(dá)

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)屬于硬骨魚綱，鰈形目鲆科，原產(chǎn)于歐洲大西洋海域，是世界市場(chǎng)公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)比目魚類之一[1]，自1992年被引入我國(guó)后，迅速成為我國(guó)北方沿海省份主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一。近年來(lái)，伴隨養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，影響了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，我國(guó)對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物的病害防治仍然以化學(xué)防治為主，因此，抗生素類藥物被大量使用，導(dǎo)致環(huán)境污染，所引發(fā)的食品安全問(wèn)題受到社會(huì)各界的關(guān)注。

遲緩愛(ài)德華氏菌屬于腸桿菌科的愛(ài)德華菌屬(Edwardsiella)，是繼鰻弧菌后又一種給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失的病原菌[2-4]。魚用疫苗是一種能夠激發(fā)魚體產(chǎn)生自動(dòng)免疫的生物制劑，可以利用疫苗技術(shù)有效預(yù)防遲緩愛(ài)德華氏菌病。但是，疫苗的使用效果受免疫策略的影響。有研究表明，不同水溫對(duì)已接種草魚輪狀病毒疫苗的草魚免疫力影響顯著[5]；不同佐劑的疫苗對(duì)大鯢的免疫力能產(chǎn)生不同的影響[6]；注射、口服免疫菌蛻疫苗對(duì)羅非魚均能產(chǎn)生免疫效果[7]。目前，關(guān)于擁擠脅迫對(duì)接種疫苗免疫力的影響相關(guān)報(bào)道還很少，因此有必要明確兩者之間的關(guān)系。

擁擠脅迫作為一種常見(jiàn)脅迫因子，可導(dǎo)致免疫相關(guān)蛋白和基因變化。據(jù)報(bào)道[8]，擁擠脅迫降低塞內(nèi)加爾鰨機(jī)體免疫功能。相似的研究結(jié)果在金頭鯛、虹鱒和羅非魚的研究中也有報(bào)道[9-11]。此外，擁擠脅迫也會(huì)引起免疫球蛋白M基因和熱休克蛋白(HSP70)基因表達(dá)的變化。本研究是在工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖中對(duì)大菱鲆接種已減毒遲緩愛(ài)德華氏菌疫苗，比較不同養(yǎng)殖密度對(duì)大菱鲆同一時(shí)間點(diǎn)的部分免疫指標(biāo)及應(yīng)激指標(biāo)的變化情況，確定對(duì)大菱鲆免疫力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所用大菱鲆飼養(yǎng)于煙臺(tái)市山東東方海洋科技股份有限公司開(kāi)發(fā)區(qū)分公司的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。該系統(tǒng)有3個(gè)水池，每個(gè)水池體積3 m3，均采用(150±10)g、健康以及體表無(wú)損傷的大菱鲆，實(shí)驗(yàn)采用的疫苗來(lái)自華東理工大學(xué)張?jiān)d教授實(shí)驗(yàn)室[12]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與日常管理

實(shí)驗(yàn)設(shè)置低、中、高3個(gè)密度組，分別為5、10和20 kg/m2，每個(gè)密度組設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組。每個(gè)密度組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。每天8:00和16:00進(jìn)行投喂，日投喂量為體質(zhì)量的1.2%左右，根據(jù)攝食情況和大菱鲆的體重變化隨時(shí)調(diào)整。水循環(huán)速率為24次/天，日換水量為100%。實(shí)驗(yàn)魚在系統(tǒng)中暫養(yǎng)半個(gè)月后開(kāi)始注射疫苗，注射時(shí)將魚撈出后用MS-222進(jìn)行麻醉，對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行腹腔注射減毒疫苗，對(duì)照組則注射等量的生理鹽水。

1.3 樣品采集

共進(jìn)行9次取樣，第1次取樣是注射疫苗前的第1天，第2次取樣為注射疫苗后的第1周，以后每周取樣1次。取樣前將大菱鲆置于200 mg/L的MS-222中做深度麻醉，避免對(duì)魚的刺激。每次取樣5尾魚，用注射器取尾靜脈血3 mL，放入5 mL離心管中保存，每個(gè)注射器內(nèi)加入0.5 mL的肝素鈉作為抗凝劑，4℃冰箱過(guò)夜，用轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心30 min，取上清液放到凍存管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取抽完血的魚的肝臟、脾臟、頭腎、腸、鰓和皮膚，用遇冷的生理鹽水漂洗去血液，減去組織表面的結(jié)締組織，用剪刀將其剪成1 mm大小放入凍存管中，將凍存管放入液氮中暫時(shí)保存，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長(zhǎng)期保存，以便日后用于RNA提取。

1.4 水質(zhì)與血液免疫指標(biāo)測(cè)定

1.5 基因表達(dá)

利用RNA快速提取試劑盒(寶生物工程〈大連〉有限公司)提取脾臟、頭腎、鰓和皮膚組織的總RNA，提取方法按試劑盒說(shuō)明書操作。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara Dalian,China)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，放置于20μL的RNAse free dH2O中，在-80℃冰箱中保存待用。

本實(shí)驗(yàn)所用的引物通過(guò)Genbank相關(guān)基因設(shè)計(jì)。所有引物由上海生物工程有限公司合成，按照使用說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)。采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)取2μL cDNA、10μL的SYBR Prime Ex Taq ，反應(yīng)條件為：95℃3 min，然后40個(gè)循環(huán)(95℃15S，57℃60S，讀板記錄熒光量)，最后72℃3 min。以β-actin為內(nèi)參，對(duì)得到的各樣品Ct值進(jìn)行均一化處理，以低密度組的值為基準(zhǔn)，應(yīng)用2-ΔΔCt法[16]分析實(shí)驗(yàn)組中的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)參數(shù)的變化

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中DO、T、pH和鹽度相對(duì)穩(wěn)定，分別維持在(8±0.5)mg/L、 (18±1)℃、(7.5±0.3)和(28±1)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異。氨氮、亞硝酸鹽和可溶性磷酸鹽的濃度和COD有略微上升的趨勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差異，不同密度組之間也沒(méi)有明顯差異(圖1)。

2.2 接種疫苗后不同密度組大菱鲆血清免疫和應(yīng)激指標(biāo)的變化

2.2.1 對(duì)白細(xì)胞介素1β(1L-1β)的影響

在接種疫苗前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中不同密度組大菱鲆的1L-1β水平差異不顯著，接種操作后，實(shí)驗(yàn)組中的高密度組大菱鲆的1L-1β濃度迅速升高，達(dá)到峰值后開(kāi)始下降并趨于平穩(wěn)，而低密度組的1L-1β的濃度在第2周達(dá)到峰值后開(kāi)始下降直至趨于平穩(wěn)；對(duì)照組中的中、高密度組呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)的趨勢(shì)，低密度組呈現(xiàn)先相對(duì)平穩(wěn)后上升的趨勢(shì)(圖2A)。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組中，自第2周起低密度組中的1L-1β濃度顯著高于其它組；在對(duì)照組中，自第8周起低密度組的1L-1β的濃度明顯高于其它密度組(P<0.05)。

圖1 養(yǎng)殖密度對(duì)大菱鲆水質(zhì)指標(biāo)的影響

圖2 擁擠脅迫對(duì)血液免疫指標(biāo)的影響

2.2.2 對(duì)已免疫大菱鲆補(bǔ)體C3的影響

接種疫苗之前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的不同密度組大菱鲆補(bǔ)體C3濃度無(wú)顯著差異，接種操作后，實(shí)驗(yàn)組各密度組中C3濃度均顯著升高，在第3周達(dá)到峰值并緩慢下降，趨于平穩(wěn)；對(duì)照組中的C3濃度呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)的趨勢(shì)(圖2B)。結(jié)果顯示，自第2周起，實(shí)驗(yàn)組中的低密度組大菱鲆C3濃度顯著高于其它組(P<0.05)；對(duì)照組未出現(xiàn)明顯差異。

2.2.3 對(duì)已免疫大菱鲆總免疫球蛋白M(IgM)的影響

接種疫苗之前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中不同密度組大菱鲆總IgM的濃度差異不顯著，接種操作后，實(shí)驗(yàn)組中各密度組的IgM濃度均顯著升高，在第2周達(dá)到峰值后并緩慢下降，趨于平穩(wěn)，對(duì)照組中、高密度組的IgM呈現(xiàn)一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的趨勢(shì)，低密度組先呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)，后上升的趨勢(shì)(圖2C)。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組中，自第2周起低密度組中大菱鲆的總IgM濃度顯著高于其它組(P<0.05)；對(duì)照組未出現(xiàn)明顯差異。

2.2.4 對(duì)已免疫大菱鲆溶菌酶(LZM)的影響

接種疫苗之前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的不同密度組中大菱鲆LZM濃度差異不顯著，接種操作后，實(shí)驗(yàn)組中各密度組的LZM濃度均顯著升高，中、高密度組在第2周達(dá)到峰值后開(kāi)始緩慢下降，最后趨于平穩(wěn)，而低密度組在第3周達(dá)到峰值后緩慢下降，后趨于平穩(wěn)；對(duì)照組呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)趨勢(shì)(圖2D)。結(jié)果顯示，自第3周起，低密度組中大菱鲆的LZM濃度顯著高于其它組(P<0.05)；對(duì)照組中未出現(xiàn)明顯差異。

2.2.5 對(duì)已免疫大菱鲆腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響

接種疫苗之前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同密度組中的大菱鲆TNF-α的濃度差異不顯著，接種操作后，實(shí)驗(yàn)組中各密度組的TNF-α濃度均顯著升高，在第3周達(dá)到峰值后開(kāi)始緩慢下降，最后趨于平穩(wěn)；對(duì)照組則呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)的趨勢(shì)(圖2E)。結(jié)果顯示，自第3周起，實(shí)驗(yàn)組中低密度組大菱鲆的TNF-α濃度顯著高于實(shí)驗(yàn)組中的其它組(P<0.05)，對(duì)照組中未出現(xiàn)明顯差異。

2.2.6 對(duì)已免疫大菱鲆皮質(zhì)醇(Cortisol)的影響

接種疫苗之前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的不同密度組中大菱鲆皮質(zhì)醇濃度的差異不顯著，接種操作后，實(shí)驗(yàn)組中各密度組的皮質(zhì)醇濃度均呈現(xiàn)先上升后下降，最后都趨向平穩(wěn)，低密度組在第2周達(dá)到峰值后緩慢下降，中、高密度組在第4周達(dá)到峰值后開(kāi)始下降；對(duì)照組中低密度組呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)的趨勢(shì)，中、高密度組呈現(xiàn)先保持相對(duì)平穩(wěn)后上升的趨勢(shì)(圖2F)。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組中，自第3周起，中、高密度的皮質(zhì)醇濃度顯著高于低密度組；在對(duì)照組中，自第7周起低密度組皮質(zhì)醇濃度顯著低于中、高密度組(P<0.05)。

2.3 已免疫大菱鲆的部分免疫基因和應(yīng)激基因表達(dá)量的變化

2.3.1 熱休克蛋白基因(HSP70)的變化

接種疫苗前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的各組織間的IgM表達(dá)量差異不顯著；接種操作后，實(shí)驗(yàn)組各密度組的組織表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)(圖3A,C,D)。

在第2周以后，脾臟、鰓和皮膚中IgM基因表達(dá)量達(dá)到最大值后開(kāi)始下降(圖3A,C,D),在第3周后，頭腎的IgM表達(dá)量達(dá)到最大值后開(kāi)始下降(圖3B)。對(duì)照組中除低密度組中的頭腎組織表達(dá)量自第7 周起IgM的表達(dá)量出現(xiàn)一個(gè)上升外，其它各密度組的各個(gè)組織均呈現(xiàn)一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的趨勢(shì)(圖3A,B,C,D)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，自第2周起，實(shí)驗(yàn)組中低密度組的顯著高于同期中密度組，而中密度組的又顯著高于同期的高密度組；對(duì)照組中、低密度組的頭腎組織，自第七周起顯著高于頭腎組織中、高密度組的IgM表達(dá)量外，其它組織均為出現(xiàn)顯著的差異 (圖3A,B,C,D，P<0.05)。

2.3.2 免疫球蛋白M基因(IgM)的變化

接種疫苗前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同組織HSP70的表達(dá)量差異不顯著，接種操作后，實(shí)驗(yàn)組中的各個(gè)密度組各個(gè)組織的HSP70表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降，最后穩(wěn)定的趨勢(shì)，對(duì)照組的各密度組呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)的趨勢(shì)(圖4A,B,C,D)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中各密度組在頭腎、脾臟和鰓的表達(dá)量在第2周后，高密度組顯著高于同期中、低密度組的HSP70表達(dá)量(圖4A,B,C，P<0.05)，而在皮膚中的表達(dá)量在第3周后，高密度組顯著高于同期中、低密度組的HSP70的表達(dá)量(圖4D，P<0.05)；對(duì)照組間未出現(xiàn)顯著差異(圖4A,B,C,D，P<0.05)。

圖3 擁擠脅迫對(duì)IgM相對(duì)表達(dá)量的影響

圖4 擁擠脅迫對(duì)HSP70相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 水質(zhì)變化對(duì)大菱鲆免疫指標(biāo)的影響

3.2 擁擠脅迫對(duì)接種疫苗后大菱鲆血清免疫和應(yīng)激指標(biāo)的影響

有研究表明，擁擠脅迫會(huì)對(duì)魚類的免疫機(jī)能產(chǎn)生影響[21-22]。血液中含有多種免疫物質(zhì)，如1L-1β、LZM、IgM、補(bǔ)體C3和TNF-α等，在抵御物理、化學(xué)和生物等因素脅迫中具有非常重要的作用[23]。

補(bǔ)體在魚類抵抗微生物感染過(guò)程中扮演這重要角色，啟動(dòng)后能夠參與機(jī)體靶細(xì)胞溶解和調(diào)理反應(yīng)，其中補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)最主要的成分之一，激活后具有溶血、溶菌、調(diào)理、免疫吸附等生物學(xué)功能[24]。擁擠脅迫對(duì)黃姑魚補(bǔ)體C3的影響差異不顯著[25]；而在施氏鱘稚魚中，隨養(yǎng)殖密度的逐漸增大，補(bǔ)體C3呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)[26]。這同本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論一致。不同密度組大菱鲆經(jīng)免疫刺激2周后，補(bǔ)體C3隨密度的逐漸增大而減少。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中大菱鲆血清補(bǔ)體C3濃度在免疫達(dá)到峰值的時(shí)間與聶芬[26]研究黃顙魚補(bǔ)體C3濃度達(dá)到峰值的時(shí)間相同。因此，可以推測(cè)擁擠脅迫能夠通過(guò)降低大菱鲆補(bǔ)體C3的濃度，進(jìn)而影響降低大菱鲆的免疫力。

IgM是魚類最主要的免疫球蛋白，是當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和細(xì)胞溶解活性。IgM廣泛應(yīng)用于評(píng)估魚類的免疫水平，是由相關(guān)的免疫球蛋白基因產(chǎn)生的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第1周IgM在血清中及部分組織表達(dá)量達(dá)到峰值，這與李桂歡[28]研究羅非魚以及王玉娟[17]研究大菱鲆的結(jié)果相類似，而Vargas-Chacoff等[29]對(duì)智利亞南極魚研究發(fā)現(xiàn)，在高密度(60 kg/m3)養(yǎng)殖條件下，IgM濃度和低密度(3.1 kg/ m3)條件下并沒(méi)有差異。但在本研究中，當(dāng)大菱鲆養(yǎng)殖密度達(dá)到20 kg/m2時(shí)，免疫球蛋白的濃度顯著降低。因此，擁擠脅迫能通過(guò)影響IgM的表達(dá)量來(lái)影響IgM的濃度，使高密度組大菱鲆的免疫力降低。

LZM廣泛存在于生物體液、血清和巨噬細(xì)胞中，在抵御外來(lái)病原菌方面發(fā)揮著重要作用，其活性在一定程度上能說(shuō)明魚非特異性免疫的體液免疫狀態(tài)，也能水解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁，使內(nèi)容物逸出進(jìn)而起到殺菌的作用[30]。Demers等[31]對(duì)虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖密度的升高，LZM水平顯著升高。而本研究結(jié)果則顯示低密度組的LZM水平顯著高于中、高密度組，這同俄羅斯鱘幼魚應(yīng)對(duì)不同密度脅迫時(shí)LZM應(yīng)答規(guī)律[32]相同。但在本研究中，接種疫苗后LZM出現(xiàn)急劇上升，同樣，與孫金輝等[33]研究虹鱒時(shí)發(fā)現(xiàn)LZM在第三周達(dá)到最大值的時(shí)間相類似。因此，擁擠脅迫能夠通過(guò)降低大菱鲆的LZM濃度，進(jìn)而降低高密度組大菱鲆的免疫力。

1L-1β和TNF-α是兩種主要的促炎細(xì)胞因子。1L-1β能夠通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞、相關(guān)組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育而在炎癥中發(fā)揮著作用，并且具有調(diào)節(jié)代謝、造血和免疫學(xué)活性等功能[34]；TNF-α是當(dāng)病原入侵時(shí)，由巨噬細(xì)胞或者是單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子，能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞，還在細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用[35]，在抵御寄生蟲(chóng)和病原微生物中充當(dāng)介質(zhì)，同時(shí)在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著治療作用[36-38]。有研究表明，急性擁擠脅迫以顯著誘導(dǎo)1L-1β和TNF-α基因表達(dá)上調(diào)，這可能和皮質(zhì)醇濃度上調(diào)有關(guān)[39-40]，但長(zhǎng)期的密度脅迫可導(dǎo)致1L-1β和TNF-α基因表達(dá)下調(diào)[10]，這與本研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)中，大菱鲆接種疫苗后，1L-1β和TNF-α的濃度快速升高并達(dá)到最大值，這與幼齡大馬哈魚接受殺鮭氣單胞菌疫苗進(jìn)行腹腔免疫時(shí)，魚體腎臟和脾臟中1L-1β和TNF-α基因的表達(dá)規(guī)律相類似[41]。因此，擁擠脅迫能夠通過(guò)抑制1L-1β和TNF-α的基因表達(dá)，影響這兩種促炎細(xì)胞因子濃度，進(jìn)而導(dǎo)致高密度組免疫力降低。

3.3 擁擠脅迫對(duì)接種疫苗后大菱鲆血清皮質(zhì)醇濃度的影響

皮質(zhì)醇是一種重要的應(yīng)激激素，其由丘腦下部—垂體—腎間組織軸所分泌[42]，其上升是被看成魚類應(yīng)激的靈敏信號(hào)[43]。因此，血清皮質(zhì)醇水平可作為評(píng)價(jià)魚類應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)血清皮質(zhì)醇濃度進(jìn)行了大量研究。如：擁擠脅迫對(duì)緣石脂鯉的血漿皮質(zhì)醇濃度并沒(méi)有產(chǎn)生影響[44]；擁擠脅迫使鯽魚血液皮質(zhì)醇濃度在幾天內(nèi)顯著升高，隨后雖有下降但高密度組一直保持較高濃度[45]；高密度養(yǎng)殖虹鱒的皮質(zhì)醇濃度會(huì)明顯高于低密度組的皮質(zhì)醇濃度[46]；牙鲆研究中也發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律[47]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接種疫苗初期大菱鲆皮質(zhì)醇濃度上升，這與張意敏等[48]研究羅非魚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。因此推測(cè)，這主要是因?yàn)槠べ|(zhì)醇是一種快速響應(yīng)的應(yīng)激激素，接種操作對(duì)大菱鲆的應(yīng)激刺激效應(yīng)隨著時(shí)間推移已經(jīng)不顯著，而養(yǎng)殖密度造成的慢性擁擠脅迫逐漸體現(xiàn)出來(lái)，導(dǎo)致高密度組皮質(zhì)醇濃度高于其它組，這類似于虹鱒中的研究發(fā)現(xiàn)[46]。因此，擁擠脅迫能夠使魚長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致魚體免疫力下降。

3.4 擁擠脅迫對(duì)接種疫苗后大菱鲆部分免疫基因和應(yīng)激基因表達(dá)量的影響

HSPs主要作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)折疊、組裝、降解以及細(xì)胞內(nèi)定位，在魚類中HSP70是研究最廣泛的熱休克蛋白之一，其在正常情況下就可以進(jìn)行表達(dá)，在溫度、鹽度、低氧、滲透壓以及微生物感染等環(huán)境因子的脅迫下，其表達(dá)量就會(huì)顯著增加[49]。本研究結(jié)果顯示，大菱鲆接種疫苗后，HSP70表達(dá)量在第一天就出現(xiàn)了急劇上升，這同先前于大菱鲆中研究結(jié)論[50]相同；養(yǎng)殖到第2周時(shí)低密度與中高密度出現(xiàn)了明顯差異，這與在海鱸和施氏鱘的研究結(jié)果[51-52]相類似。擁擠脅迫能夠通過(guò)降低HSP70的基因表達(dá)量，進(jìn)而影響大菱鲆的免疫力。

4 結(jié)論

各個(gè)養(yǎng)殖密度組在注射疫苗后，經(jīng)過(guò)2個(gè)月的養(yǎng)殖，高密度組能夠引起各血液免疫指標(biāo)發(fā)生不利的變化，低密度組的IgM、LZM、1L-1β、TNF -α和C3濃度高于中、高密度組，而皮質(zhì)醇的濃度高密度組則顯著高于低密度組。通過(guò)基因表達(dá)分析顯示，高密度(20 kg/m2)引起脾臟、頭腎、鰓和皮膚組織中的免疫相關(guān)基因表達(dá)，高密度組HSP70免疫基因表達(dá)量明顯高于中、低密度組；低密度組(5 kg/m2)的IgM表達(dá)量明顯高于中(10 kg/m2)、高密度組(20 kg/m2)。研究表明，擁擠脅迫降低了大菱鲆的免疫能力，在低密度下養(yǎng)殖，大菱鲆的免疫能力較好。

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Effects of crowding stress on immunity and stress index of turbot injected with vaccine

YIN Shuting1,2，LIU Baoliang2，HUANG Bin2，HUO Huanhuan2，WANG Weifang2，LEI Jilin2，ZHOU Shun1

(1MarineScienceandEngineeringCollege,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109China;2YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071,China)

In this study,the responses of turbots to crowding stress were studied though obverting the changes of immune and stress index in blood,spleen,head kidney,gills and skin before and after being inoculated with attenuatedEdwardsiellatardavaccine,using turbots cultured in different initial stocking densities (low density:5 kg/m2,medium density:10 kg/m2,high density:20 kg/m2).The results showed that:the immune indexes such as serum interleukin (1L-1β),complement (C3),immunoglobulin M (IgM),lysozyme (LZM) and tumor necrosis factor (TNF-α) of turbots in the low density group were significantly higher than those of the medium and high density groups (P<0.05);the blood cortisol level of turbots in the low density group was significantly higher than that of the medium and low density groups (P<0.05);heat shock protein (HSP70) gene expression in the high density turbots was significantly higher than that of the medium and low density groups;and,immunoglobulin M (IgM) expression in low density turbots was higher than that of the medium and high density groups.Above all,in order to improve the immune effect and reduce stress response of turbot,it is suggested to adopt low density (5 kg/m2) breeding system.

Scophthalmusmaximus;Edwardsiellatardavaccine;crowding stress;serum immune index;gene expression

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.01.006

2016-10-29

2017-01-18

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31402315)；國(guó)家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系高效養(yǎng)殖模式崗(CARS-50-G10)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新漁業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-12-06)；青島市市南區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016-3-006-ZH)

殷述亭(1990—)，男，碩士研究生，研究方向：工廠化健康養(yǎng)殖技術(shù)。E-mail：yst0325@163.com

周順(1970—)，男，教授，研究方向：病害免疫與防治。E-mail：zs1123@sina.com

S942.5

A

1007-9580(2017)01-026-09