陸芬，張躍，杜森杰，李紅英，張麗

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，南京210008)

染色體微陣列分析技術(shù)在不明原因智力低下患兒中的應(yīng)用

陸芬，張躍，杜森杰，李紅英，張麗

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，南京210008)

目的 探討染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)在不同原因智力低下患兒中的應(yīng)用效果。方法 應(yīng)用蘇州鉑金埃爾默公司提供的染色體微陣列芯片CGX-SNP對(duì)83例無(wú)明顯高危因素智力低下兒童進(jìn)行基因組學(xué)研究。CMA分析所發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失/微重復(fù)(CNVs)，進(jìn)一步通過(guò)熒光原位雜交或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 38例(45.8%，38/83)患兒檢測(cè)到染色體異常。單親二倍體1例(1/38,2.6%)，三體2例(2/38,5.3%)，短臂單體1例(1/38,2.6%)，大片段重復(fù)3例(3/38,7.9%)，大片段缺失2例(2/38,5.3%)，CNVs 29例(29/38,76.3%),檢測(cè)到攜帶臨床致病性CNVs患兒 25例，檢出率達(dá)30.1%。結(jié)論 CMA檢查可及時(shí)發(fā)現(xiàn)智力低下患兒染色體異常，將檢出率提高至10%以上。

智力低下；染色體微陣列分析；染色體微缺失；染色體微重復(fù)；基因組學(xué);兒童

智力低下(MR)是指智力損傷發(fā)生在發(fā)育時(shí)期、主要表現(xiàn)為智力明顯低于一般人水平，并伴有明顯的適應(yīng)行為障礙[1]。2000年抽樣調(diào)查報(bào)告證實(shí)，我國(guó)0～6歲兒童智力殘疾現(xiàn)患率為0.931%，相當(dāng)于我國(guó)有智力殘疾兒童1 300萬(wàn)人，年均發(fā)現(xiàn)率為0.133%[2]，其中2/3原因不明。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起MR的先天、遺傳因素占11.21%[3]，居第4位，該因素引起的兒童MR程度以重型為主，提示在胎兒大腦發(fā)育初期，智力損害程度明顯高于后天致殘。同時(shí)該因素導(dǎo)致的MR治療效果差，因此需要合理的檢測(cè)手段確定MR的病因。由于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析方法如G顯帶染色體分析法，分辨率不高，僅能檢測(cè)較大的染色體畸變(>5 Mb)，因此，許多被診斷為“正?！苯Y(jié)果的病例往往隱藏著染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的異常。染色體微陣列(CMA)技術(shù)是最近發(fā)展起來(lái)的主要用于檢測(cè)染色體亞顯微缺失/微重復(fù)(CNVs)的一項(xiàng)技術(shù)，能將臨床致病性CNVs檢出率提高到10%以上[4]。本研究探討了其應(yīng)用于MR患兒中的價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年6月～2017年3月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院就診的不明原因MR患兒83例，均符合Gesell發(fā)育診斷量表(Gesell Development Scale，北京修訂版，1986年)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。年齡3個(gè)月～4歲，其中男42例、女41例，適應(yīng)行為能區(qū)發(fā)育商為24～73分、多數(shù)為40～54分。無(wú)相關(guān)家族史，83例患兒認(rèn)知落后，所有家系均簽署知情同意書(shū)，同意參加全基因組CMA的檢測(cè)。本研究獲得南京兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：不明病因的MR患兒指排除出生時(shí)、出生后相關(guān)高危因素，同時(shí)具有以下至少1個(gè)條件：伴其他系統(tǒng)畸形；具有典型面部特征或異常面容；母親具有異常妊娠史。排除標(biāo)準(zhǔn)：已明確的遺傳代謝性疾病(如苯丙酮尿癥、甲狀腺功能減退癥等)導(dǎo)致的MR。

1.2 診斷方法 采用Gesell發(fā)育診斷量表-中文修訂版進(jìn)行診斷。Gesell發(fā)育量表包括評(píng)定兒童的大運(yùn)動(dòng)、精細(xì)動(dòng)作、語(yǔ)言、社交、適應(yīng)行為5個(gè)能區(qū)，計(jì)算每個(gè)能區(qū)的發(fā)育商(DQ)。DQ=DA/CA×100[DA：發(fā)育年齡(周)；CA：實(shí)際年齡(周)]；根據(jù)適應(yīng)行為能區(qū)發(fā)育商高低判斷MR程度：輕度:55≤DQ≤75；中度:40≤DQ≤54；重度:25≤DQ≤39；極重度:DQ<25。

1.3 檢測(cè)方法 采集病史，同時(shí)采取患兒靜脈血2 mL，應(yīng)用鉑金埃爾默DNA提取試劑盒提取基因組DNA，所用的芯片為蘇州鉑金埃默公司提供的CGX-SNP芯片。CMA分析所發(fā)現(xiàn)的CNVs都進(jìn)一步通過(guò)熒光原位雜交或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)所得的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用蘇州鉑金埃爾默數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。參照國(guó)際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)DGV、UCSC Genome Browser、DECIPHER以及ISCA數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)判讀CNV。嚴(yán)格按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)的指南[5]，將CNVs分為4個(gè)等級(jí)：臨床致病性CNVs，臨床可能致病性CNVs，臨床意義不確定性CNVs，良性CNVs。

2 結(jié)果

本研究中，MR患兒83例，染色體異常38例(38/83，45.8%)。單親二倍體1例(1/38,2.6%)，三體2例(2/38,5.3%)，臂單體1例(1/38,2.6%)，大片段重復(fù)3例(3/38,7.9%)，大片段缺失2例(2/38,5.3%)，CNVs 29例(29/38,76.3%)。

根據(jù)CMA結(jié)果解讀，29例CNVs患兒中，攜帶臨床致病性CNVs 25例(25/29,89.3%)，攜帶臨床意義不能確定性CNVs 4例(4/29,13.7%)。25例攜帶臨床致病性CNVs的患兒中染色體微缺失17例(17/25,68.0%)，微重復(fù)4例(4/25,16.0%),微重復(fù)+微缺失4例(4/25,16.0%)?；純篊NVs分布于多個(gè)不同的染色體區(qū)域，分別為X染色體4例(4/25,16.0%)、1號(hào)染色體3例(3/25,12.0%)、2號(hào)染色體2例(2/25,8.0%)、7號(hào)染色體2例(2/25,8.0%)、15號(hào)染色體2例(2/25,8.0%)、17號(hào)染色體2例(2/25,8.0%)，其余14例(10/25,40.0%)為散發(fā)CNVs。

25例攜帶臨床致病性CNVs的患兒中Angelman綜合征/Prader-Willi 綜合征2例(15q11.2q13.1區(qū)域微缺失)、Wolf-Hirschhorn綜合征1例(4p16.3區(qū)域微缺失)、Miller-Dieker綜合征1例(17p13.3區(qū)域微缺失)、Williams綜合征1例(7q11.23區(qū)域微缺失)、Waardenburg綜合征1例(2q35-q36.1區(qū)域微缺失)、1p36缺失綜合征1例(1p36.31-p36.33微缺失)、MECP2重復(fù)綜合征1例(Xq28區(qū)域441.88 kB的重復(fù))，其余17例未明確提示某種CNVs。

本研究共83例患兒，25例患兒檢測(cè)到攜帶臨床致病性CNVs，檢出率達(dá)30.1%。我們進(jìn)一步對(duì)攜帶臨床致病性CNVs中患兒其中3例的父母樣本進(jìn)行了CMA檢測(cè)，結(jié)果顯示2例患兒的CNVs遺傳自健康父母中的一方，1例患兒的CNVs為新發(fā)變異。

3 討論

MR作為一組表型、基因型高度異質(zhì)性的疾病，遺傳病因復(fù)雜。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析方法如G顯帶染色體分析法，其分辨率不高，僅能檢測(cè)較大的染色體畸變，CMA是最近發(fā)展起來(lái)的主要用于檢測(cè)染色體CNVs的一項(xiàng)技術(shù)，能將CNVs檢出率提高到10%以上。目前CMA主要有兩大平臺(tái)。一種是比較基因組雜交芯片(aCGH)，其基本原理是將待測(cè)樣本DNA與正常對(duì)照樣本DNA分別用不同的熒光標(biāo)記，通過(guò)與芯片上固定探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性雜交獲得定量的拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果；另外一種是單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(SNP array)，其基本原理是將探針連接在微珠上，然后將攜帶探針的微珠隨機(jī)黏附在芯片上，待測(cè)樣本DNA和探針進(jìn)行雜交及單堿基延伸，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)掃描，分析待測(cè)樣本CNV及基因型，該平臺(tái)在分析患者的基因組時(shí)不需要正常對(duì)照樣本[6]。通過(guò)aCGH技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢出CNV，而SNP array除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測(cè)出大多數(shù)的單親二倍體和一定比例的嵌合體[7]。同時(shí)涵蓋CNV和SNP的芯片具備雙重優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)的敏感性、特異性、可靠性等方面得到很大提高。

美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)2013年版指南[8]提出，“如產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)超聲異常，CMA檢測(cè)方法最為有益”，CMA可替代傳統(tǒng)核型分析。2016年7月《中華兒科雜志》發(fā)布了《染色體基因組芯片在兒科遺傳病的臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》[9]，為CMA在我國(guó)的應(yīng)用提供了指南。目前國(guó)內(nèi)外CMA在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用較廣泛，Shaffer等[10～12]通過(guò)大量產(chǎn)前診斷樣本(主要來(lái)自羊水、流產(chǎn)樣本等)檢測(cè)提示有臨床意義的CNVs檢出率上升為6.0%～6.5%。常亮等[13]通過(guò)采用SNP array及染色體核型分析對(duì)2012年7月～2013年12月在北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的141例產(chǎn)前診斷為高危孕婦進(jìn)行的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)染色體核型分析異常率為6.4%，SNP array異常率為11.3%，兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)出的異常核型率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吳曉麗等[14]采用CMA技術(shù)對(duì)88例染色體核型分析正常的先天性心臟病胎兒進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)14例(16%)胎兒CNV結(jié)果為臨床致病性CNV。這些研究均表明CMA在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用廣泛，且陽(yáng)性率高。CMA可以作為產(chǎn)前診斷標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的一部分應(yīng)用于臨床。國(guó)內(nèi)劉欣等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，CMA對(duì)各種類(lèi)型神經(jīng)發(fā)育性疾病患兒的分子診斷率并不一致。其中，CMA對(duì)MR患兒的分子診斷率最高，達(dá)26.3%。

本研究對(duì)83例MR患兒進(jìn)行了CMA的檢測(cè)，共檢測(cè)出25例患兒攜帶臨床致病的CNVs，檢出率為30.1%。明顯高于研究[6]報(bào)道的15%～20%的檢出率。分析可能原因?yàn)楸狙芯坎±龜?shù)相對(duì)較少，增加了染色體基因CNVs異常檢出率，需進(jìn)一步加強(qiáng)病例收集。25例攜帶臨床致病的染色體微失衡患兒，其中16例伴有面容特殊或者其他系統(tǒng)畸形，所以臨床上MR同時(shí)伴有面容特殊及其他系統(tǒng)畸形患兒應(yīng)首先選擇CMA。

目前臨床上常見(jiàn)的CNVs綜合征至少有67種,如Angelman 綜合征、Prader-Willi 綜合征、Wolf-Hirschhorn 綜合征、DiGeorge 綜合征、Miller-Dieker 綜合征、Williams綜合征等。國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究結(jié)果顯示，臨床致病性CNVs患兒中，Prader-Willi綜合征/Angelman綜合征(PWS/AS)的所占比例最高[16]。但本研究提示，X染色體臨床致病的CNVs最高，1號(hào)染色體臨床致病CNVs次高，PWS/AS的所占比例位于第3位，考慮可能與本研究病例數(shù)少有關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)DiGeorge綜合征患兒。

國(guó)外多個(gè)研究表明，Williams綜合征、Miller-Dieker綜合征、Wolf- Hirschhorn 綜合征、1p36缺失綜合征、Waardenburg綜合征Ⅰ型均具有特殊面容，且各自具有特征性臨床表現(xiàn)，但目前國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少，對(duì)一些面容特殊合并MR兒童建議盡早完善CMA助診,對(duì)于診斷、判斷預(yù)后及優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)有重要意義。

本研究結(jié)果也表明，CNVs在中國(guó)兒童MR患兒中發(fā)病率高，這一結(jié)果肯定了CMA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，但目前仍存在一些挑戰(zhàn)，如對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)的缺乏和臨床意義未知的CNVs沒(méi)法解釋等。本研究29例CMA陽(yáng)性患兒中就有4例(13.8%)臨床意義不明。但從研究的角度，隨著病例的積累及數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，這些臨床意義不明確變異最終可能成為與疾病相關(guān)的新的致病區(qū)域，為以后的分析提供拷貝數(shù)多態(tài)性參考。

對(duì)面容異常、MR、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢等患兒進(jìn)行CMA檢查，可及時(shí)發(fā)現(xiàn)染色體異常。從優(yōu)生考慮,CMA檢測(cè)對(duì)患兒家庭有明顯指導(dǎo)意義,比如本研究?jī)?nèi)有4例患兒存在2處CNVs，根據(jù)結(jié)果建議患兒父母進(jìn)一步完善核型分析，以判斷患兒CNV是否來(lái)自父母，或源于父母的染色體平衡易位，評(píng)估再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。又如MECP2重復(fù)綜合征，該患兒家族譜系中存在該變異，有必要對(duì)家族中其他成員進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，為家族中可能的攜帶者進(jìn)行遺傳咨詢(xún)和必要的遺傳學(xué)檢測(cè),評(píng)估子代的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但是目前染色體芯片不能檢測(cè)染色體平衡易位(相互易位、羅賓遜易位、倒位、平衡性插入等)，且染色體嵌合性檢測(cè)精確性尚未確立，同時(shí)會(huì)檢出臨床意義不明的CNVs。對(duì)于高度懷疑染色體易位患兒建議完善染色體核型分析。CMA技術(shù)不能檢測(cè)單基因病，懷疑單基因病患兒應(yīng)首選單基因檢測(cè)。

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張躍(E-mail：feiyuezhang@126.com)

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1002-266X(2017)29-0081-03

2017-03-28)