何春卉

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣州 510000)

EV71感染手足口病患兒血清IL-6、IL-13水平變化及其原因

何春卉

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣州 510000)

目的 探討腸道病毒71型(EV71)感染引起的手足口病(HFMD)患兒血清IL-6和IL-13水平變化及其原因。方法 以EV71感染的HFMD患兒作為觀察組，健康體檢者作為對照組，用ELISA法測定兩組血清IL-6和IL-13水平。比較觀察組中嚴(yán)重程度不同(臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)的HFMD患兒血清IL-6和IL-13水平。采用利巴韋林等抗病毒治療。對比治療前后血清IL-6和IL-13水平變化。用流式細(xì)胞儀測定單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13的表達(dá)水平。EV71感染從健康人全血中分離出來的單核細(xì)胞和T細(xì)胞，制成感染陽性細(xì)胞，檢測其細(xì)胞中IL-6和IL-13的表達(dá)水平，以未感染的單核細(xì)胞及T細(xì)胞作為陰性對照細(xì)胞。結(jié)果 觀察組治療前血清中IL-6和IL-13水平與對照組相比升高(P均<0.01)。 與治療前比較，治療后觀察組不同分期患者血清IL-6和IL-13水平均下降(P均<0.01)。不同分期間，隨著臨床分期升高，血清IL-6、IL-13水平升高(P均<0.01)。與對照組比較，觀察組各分期單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13表達(dá)水平均高(P均<0.05)。EV71感染單核細(xì)胞和T細(xì)胞后，其IL-6和IL-13表達(dá)水平高于陰性對照細(xì)胞(P均<0.05)。結(jié)論 EV71感染HFMD患兒血清IL-6和IL-13水平升高，其原因可能是FV71感染的單核細(xì)胞表達(dá)IL-6和T細(xì)胞表達(dá)IL-13能力增強。

手足口??；白細(xì)胞介素6；白細(xì)胞介素13；腸道病毒71型；兒童

1957年，新西蘭首次報道了手足口病(HFMD)[1]，由于免疫力的差異，HFMD多在5歲以下兒童群體傳染，出現(xiàn)口痛、低熱、胃納差、手足口部位皰疹或潰瘍的臨床癥狀，在免疫力較強的成人群體中，除了重癥感染患者，其他多處于隱性潛伏狀態(tài)，易成為傳染源[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)柯薩奇病毒A16(CVA16)和腸道病毒71型(EV71)均能引起HFMD，且從初期的臨床癥狀上難以區(qū)分[3]。但CVA16引起的HFMD一般較少出現(xiàn)并發(fā)癥[4]，EV71引起的HFMD患者常出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[5，6]。據(jù)研究，EV71屬小RNA病毒科，腸道病毒屬，是一種正義單鏈RNA病毒[7，8]。研究表明，參與炎癥發(fā)生過程的細(xì)胞因子在EV71感染導(dǎo)致的HFMD病程中可能起了關(guān)鍵作用。但關(guān)于EV71導(dǎo)致HFMD發(fā)生的病理過程中IL-6和IL-13所起的作用研究報道較少。本研究對36例確診為EV71感染導(dǎo)致的HFMD住院患兒血清IL-6和IL-13水平變化進(jìn)行了觀察，并探討了血清IL-6和IL-13水平變化的原因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1～12月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心共收治和確診EV71感染的HFMD住院患兒36例(觀察組)，符合“手足口病治療指南(2010年版)”[9]。男20例、女16例，年齡(25.19±8.92)個月。對照組為本院同期健康體檢者20例，男11例、女9例，年齡(25.56±10.31)個月?；颊吒鶕?jù)“陜西省EV71感染重癥手足口病病例臨床診斷與治療專家共識(2014年修訂版)”的臨床特征分期[10]如下：神經(jīng)系統(tǒng)受累期(臨床Ⅱ期)患兒12例，年齡(26.32±9.81)個月；心肺衰竭前期(臨床Ⅲ期)患兒12例，年齡(23.63±10.21)個月；心肺衰竭期(臨床Ⅳ期)患兒12例，年齡(25.63±11.23)個月。兩組性別比例、年齡分布均衡。

1.2 治療方法 應(yīng)用利巴韋林10 mg(/kg·d)靜滴或喜炎平靜滴抗病毒治療1周。對于出現(xiàn)口腔潰瘍的患者，用復(fù)方氯已啶清洗口腔，康復(fù)新噴劑促進(jìn)口腔潰瘍愈合。對于體溫升高超過38.5 ℃的患兒，對其進(jìn)行物理降溫，可口服布洛芬、對乙酰氨基酚溶液降溫。患兒中需要進(jìn)行母乳喂養(yǎng)的可以繼續(xù)母乳喂養(yǎng)，對于無需母乳喂養(yǎng)的患兒保持食用清淡、易消化、維生素含量豐富的食物。

1.3 血清IL-6、IL-13水平的檢測 采用ELISA法。對照組體檢時及觀察組患兒入院及住院期間抽血。實驗步驟如下：①吸附：取血清樣品、空白對照和R&D公司試劑盒所配的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，加入反應(yīng)板的孔中，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育90 min，棄去反應(yīng)板各孔中溶液，分別加入洗滌液250 μL，振蕩1 min，棄去洗滌液，按此重復(fù)共4次；②加抗體：將生物素化抗體工作液加入各孔中，100 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min后，洗板4次；③加底物：加入酶聯(lián)底物溶液100 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min；洗板4次；④顯色：加入顯色劑100 μL/孔，避光37 ℃下孵育15 min，加入終止液100 μL/孔。用FC酶標(biāo)儀450 nm波長下測定吸光度值。

1.4 細(xì)胞中IL-6和IL-13表達(dá)的檢測 將肝素鈉抗凝的全血樣本用Ficoll密度梯度離心法分離出外周血單個核細(xì)胞，將細(xì)胞加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS，200 IU/mL rhIL-2)中，制備成濃度為2×106/mL的細(xì)胞懸液。外周血單個核細(xì)胞用100 ng/mL PMA和1 μg/mL離子霉素刺激1 h后，加入高爾基體阻斷劑，保持細(xì)胞因子在細(xì)胞中，不被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞外，孵育5 h。收集細(xì)胞，先加入表面染色的單抗試劑，用CD14圈定單核細(xì)胞和CD3圈定T細(xì)胞，細(xì)胞膜固定透化后加入IL-6和IL-13的熒光標(biāo)記抗體，固定細(xì)胞膜通透性后，用流式細(xì)胞儀對上述樣品進(jìn)行分析。

1.5 EV71感染陽性細(xì)胞中IL-6和IL-13水平的檢測 EV71病毒以MOI=5的條件感染1×107的健康人的單核細(xì)胞和T細(xì)胞，RT-PCR鑒定感染成功的單核細(xì)胞和T細(xì)胞[3]。用流式細(xì)胞術(shù)測被感染細(xì)胞的IL-6和IL-13水平，以正常的單核細(xì)胞和T細(xì)胞作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 觀察組患兒治療前后血清IL-6和IL-13水平比較 觀察組臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期治療前血清IL-6水平分別為(50.62±4.21)、(74.79±8.53)、(96.41±10.63)pg/mL，治療后分別為(24.31±6.59)、(41.09±8.64)、(68.09±15.37)pg/mL，對照組為(21.71±5.72)pg/mL；觀察組臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期IL-13水平分別為(24.62±3.57)、(38.51±5.48)、(48.74±4.87)pg/mL，治療后分別為(10.36±3.58)、(18.69±5.60)、(21.07±5.25)pg/mL，對照組為(16.53±2.72)pg/mL。觀察組治療前血清中IL-6和IL-13水平與對照組相比升高(P均<0.01)。與治療前比較，治療后觀察組不同分期患者血清IL-6和IL-13水平均下降(P均<0.01)。不同分期間，隨著臨床分期升高，血清IL-6、IL-13水平升高(P均<0.01)。

2.2 兩組單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13表達(dá)水平比較 觀察組臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期及對照組單核細(xì)胞中IL-6水平分別為(10.44±6.29)、(13.16±13.14)、(12.41±11.61)、(2.01±0.35)pg/mL，T細(xì)胞中IL-13水平分別為(8.48±5.78)、(4.04±1.39)、(5.27±3.72)、(2.43±0.46)pg/mL。與對照組比較，觀察組各分期單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13表達(dá)水平均高(P均<0.05)。

2.3 EV71感染的細(xì)胞中IL-6和IL-13水平比較EV71病毒感染的單核細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞IL-6水平分別為(1.56±0.35)、(0.36±0.14)pg/mL，IL-3水平分別為(1.82±0.75)、(0.57±0.26)pg/mL。EV71病毒感染單核細(xì)胞和T細(xì)胞后，其IL-6和IL-13水平高于陰性對照細(xì)胞(P均<0.05)。

3 討論

HFMD是多種腸道病毒所致的傳染性疾病，其多發(fā)于嬰幼兒，最常見病毒包括腸道病毒EV71在內(nèi)。其臨床表現(xiàn)為口痛、厭食、低熱,手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹或小潰瘍，多數(shù)患兒一周左右自愈，少數(shù)患兒將發(fā)展至心肌炎等嚴(yán)重疾病[2]。

既往研究表明，IL-6是一種單核細(xì)胞分泌的多功能炎性細(xì)胞因子，在多種病理過程中起作用[11]。當(dāng)機體受到病毒感染時，IL-6血清濃度會上升。IL-6在炎癥反應(yīng)中有抗炎和致炎的雙向作用，與其在機體中的含量水平相關(guān)[12]。Huang等[13]研究表明，小鼠被EV71感染初期會短暫出現(xiàn)IL-6、IL-10和IFN-γ水平升高。在使用靶向IL-6受體的抗體治療，抑制IL-6參與的信號傳導(dǎo)過程，EV71感染導(dǎo)致的組織損傷好轉(zhuǎn)、血液中病毒數(shù)量下降、炎癥水平降低[14]。說明IL-6可能參與了EV71感染致HFMD的病理過程[15]。IL-13主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)過程，促進(jìn)B細(xì)胞增殖，抑制促炎細(xì)胞因子分泌[16]。EV71感染引起的肺水腫患者及小鼠模型均顯示，受感染后血清IL-13水平升高[17，18]。觀察組血清中IL-6和IL-13水平高于對照組，且隨著HFMD臨床診斷嚴(yán)重分級越高，血清中IL-6和IL-13水平越高。提示IL-6和IL-13可能參與了EV71感染導(dǎo)致的HFMD發(fā)生和發(fā)展過程。

觀察組和對照組單核細(xì)胞 中IL-6和T細(xì)胞中IL-13水平高于對照組。結(jié)合觀察組血清中IL-6和IL-13水平偏高的測定結(jié)果，說明可能是因為單核細(xì)胞和T細(xì)胞分泌IL-6和IL-13增多，導(dǎo)致血清中其水平的升高。通過EV71體外感染健康人的單核細(xì)胞 和T細(xì)胞，測定結(jié)果顯示細(xì)胞中IL-6和IL-13表達(dá)水平升高。說明EV71導(dǎo)致HFMD的一個途徑是，通過促進(jìn)單核細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-13細(xì)胞因子，升高血清中IL-6和IL-13水平，進(jìn)而導(dǎo)致HFMD患者出現(xiàn)炎癥加重的臨床病癥。Huang等[13]研究表明，EV71感染后T淋巴細(xì)胞瘤(Jurkat細(xì)胞)分泌IL-2、IFN-ɑ、IL-6和IL-10的能力下降。本研究結(jié)果與其不同。推測可能的原因是Huang 等試驗是通過ELISA法測定培養(yǎng)48 h后細(xì)胞因子的總量，EV71感染Jurkat細(xì)胞會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，如果48 h后以樣品組與對照組中IL-6和IL-13的測得濃度來對比細(xì)胞因子的表達(dá)水平，會因為細(xì)胞數(shù)量的差別而有所差異。故本研究采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)IL-6和IL-13表達(dá)水平，通過比較單核細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)量，以及IL-6和IL-13的水平來排除其他因素的干擾。

綜上所述，EV71感染導(dǎo)致HFMD，可能的途徑是通過感染單核細(xì)胞和T細(xì)胞,促進(jìn)其分泌IL-6和IL-13，引起血清中IL-6和IL-13的水平升高，但是其分子機理仍有待進(jìn)一步研究。

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