羅禮陽，羅曉星，李明凱

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，西安710032)

香豆素類化合物的抗菌活性及其作用機(jī)制研究進(jìn)展

羅禮陽，羅曉星，李明凱

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，西安710032)

香豆素類化合物是一類含苯駢α-吡喃酮結(jié)構(gòu)的芳香含氧雜環(huán)化合物，廣泛存在于植物和微生物的代謝產(chǎn)物中，具有抗菌、抗病毒、抗凝血等生物活性。目前，對香豆素類化合物抗菌活性的研究廣泛且成績斐然。天然香豆素類化合物由于衍生物種類繁多，其抗菌活性亦不盡相同。目前認(rèn)為，香豆素類化合物的抗菌機(jī)制與細(xì)菌DNA解旋酶、群體感應(yīng)系統(tǒng)、青霉素結(jié)合蛋白等有關(guān)。

香豆素類化合物；抗菌活性；DNA解旋酶；細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)

目前，世界范圍內(nèi)細(xì)菌耐藥已呈現(xiàn)多藥耐藥趨勢，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)等超級細(xì)菌的出現(xiàn)。人類一旦感染這類細(xì)菌，可能會面臨無藥可用的境地。天然產(chǎn)物骨架的復(fù)雜性和豐富的官能團(tuán)化賦予了天然產(chǎn)物類化合物獨(dú)有的生物活性。香豆素類化合物是一類含苯駢α吡喃酮結(jié)構(gòu)的芳香含氧雜環(huán)化合物，在結(jié)構(gòu)上可以看作為順式鄰羥基桂皮酸脫水而形成的內(nèi)酯類化合物。香豆素類化合物廣泛分布于茄科、蕓香科、傘形科等植物中，如蛇床子、獨(dú)活、白芷。近年來從動物及微生物的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一些新的香豆素類化合物，如發(fā)光真菌中的亮菌素類、海洋真菌Hansfordiasinuosae中的異香豆素以及中藥僵蠶中的香豆素等[1～3]。迄今為止，已從自然界中分離了1 300余種香豆素類化合物。香豆素類化合物具有抗菌、抗病毒、抗凝血等生物活性[4～7]，尤其是其抗菌活性已被研究證實(shí)。香豆霉素A、氯香豆霉素等香豆素類抗生素已在臨床用于肺炎、敗血癥等疾病的治療。本課題組對香豆素類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和修飾，優(yōu)選出了若干對多藥耐藥細(xì)菌抗菌活性強(qiáng)的化合物，并結(jié)合文獻(xiàn)對其抗菌活性及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)、分類及其抗菌活性

根據(jù)α吡喃酮環(huán)上有無取代，7-羥基是否和C6、C8位異戊烯基成環(huán)(呋喃環(huán)、吡喃環(huán))，可將香豆素類化合物分為四類：簡單香豆素類、呋喃香豆素類、吡喃香豆素類和其他香豆素類。香豆素類化合物均具有一定的抗菌活性，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，其抗菌活性亦有區(qū)別。香豆素類化合物的抗菌活性和構(gòu)效關(guān)系比較復(fù)雜，目前尚不完全清楚。本文主要闡述前三類香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)及抗菌活性。

1.1 簡單香豆素類化合物 簡單香豆素類化合物只在香豆素苯環(huán)一側(cè)有取代基， 如羥基、甲氧基等，取代基主要位于C7位、C6位或C8位，且未形成呋喃環(huán)或吡喃環(huán)。這類化合物主要存在于傘形科植物中的傘形花內(nèi)酯和白花前胡醇、茵陳中的濱蒿內(nèi)酯、獨(dú)活中的當(dāng)歸內(nèi)酯、瑞香中的瑞香素、蛇床子中的蛇床子素、秦皮中的秦皮乙素和秦皮素、 橙皮中的橙皮油素以及東莨菪素等。

香豆素類化合物本身抗菌活性相對較低，但當(dāng)其母核上引入某些取代基后，其抗菌活性顯著增強(qiáng)。如含有長鏈取代基的香豆素類化合物歐前胡素和阿莫樹脂醇對巨大芽孢桿菌、藤黃微球菌、溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性明顯增強(qiáng)。Maracic等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在簡單香豆素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)上加入含有三氮唑的支鏈取代基后，可展現(xiàn)出優(yōu)良的抗卡他莫拉菌活性，其抗菌效果優(yōu)于阿奇霉素，最低抑菌濃度(MIC)≤0.25 μg/mL。Canning等[9]研究還發(fā)現(xiàn)，非洲傳統(tǒng)藥物曼密樹皮甲醇粗提物純化后的化合物曼密A/AA具有良好的抗菌活性，對空腸彎曲桿菌、肺炎鏈球菌和艱難梭狀芽孢桿菌的MIC分別為0.5、0.25、0.25 μg/mL。飛龍掌血在印度民間一直被用來治療咳嗽、風(fēng)濕、消化不良等。Karunai Raj等[10]從飛龍掌血根中提取、分離出白花前胡醇，并發(fā)現(xiàn)其對銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌等具有不同程度的抗菌活性。

1.2 呋喃香豆素類化合物 香豆素母核上的異戊烯基與鄰位酚羥基(7-羥基)縮合形成呋喃環(huán)，同時降解失去3個碳原子而形成的一系列化合物。如7位羥基或6位異戊烯基形成呋喃環(huán)時，結(jié)構(gòu)中的呋喃環(huán)、苯環(huán)、α吡喃酮環(huán)同處于一條直線上，即為線型呋喃香豆素類化合物；若7位羥基與8位碳上異戊烯基形成呋喃環(huán)時，結(jié)構(gòu)中的呋喃環(huán)、苯環(huán)和α吡喃酮環(huán)則在一條折線上，即為角型呋喃香豆素類化合物。呋喃香豆素類化合物在自然界中主要存在于傘形科植物中。如紫花前胡中的紫花前胡內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂素等，屬于線形呋喃香豆素類化合物；牛尾獨(dú)活中的異佛手柑內(nèi)酯、白芷素植物中的比克白芷素、紫花前胡中的紫花前胡苷等，屬于角型吠喃香豆素類化合物。

從植物中提取、分離的線型或角型呋喃香豆素類化合物均有一定抗菌活性。有研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素對大腸埃希菌(ATCC10875)、金黃色葡萄球菌(ATCC13709)等標(biāo)準(zhǔn)菌株有一定抗菌活性。Tada等[11]從傘形科植物Prangospabularia分離出氧化前胡素、歐前胡素、蛇床子素三種呋喃香豆素類化合物，并發(fā)現(xiàn)其對敏感金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌均表現(xiàn)出一定抗菌活性。Verotta等[12]從藤黃科植物鐵力木的花中分離了多種4-烷基、4-苯基、5，7-二羥基香豆素類化合物，并發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌等均具有一定抗菌活性，MIC為4～8 μg/mL。

1.3 吡喃香豆素類化合物 與呋喃香豆素類化合物相似，7位羥基與6位或8位取代基——異戊烯基縮合形成吡喃環(huán)。如7位羥基與6位異戊烯基形成吡喃環(huán)時，化學(xué)結(jié)構(gòu)中的吡喃環(huán)、苯環(huán)和α吡喃酮環(huán)處在一條直線上，即為線型吡喃香豆素類化合物，如美花椒內(nèi)酯；若7位羥基與8位異戊烯基形成吡喃環(huán)時，化學(xué)結(jié)構(gòu)中的吡喃環(huán)、苯環(huán)和α吡喃酮環(huán)處在一條折線上，即為角型吡喃香豆素類化合物，如白花前胡苷和北美芹素。常見的吡喃香豆素類化合物還有狹縫芹中的狹縫芹素、紫花前胡素以及白花前胡中的北美芹素、白花前胡丙素、白花前胡苷Ⅱ等。

目前對天然吡喃香豆素類化合物抗菌活性的研究相對較少。吡喃香豆素類化合物對結(jié)核桿菌具有一定抗菌活性。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，吡喃香豆素類化合物calanolide A對結(jié)核桿菌的藥敏株和耐藥株均有一定抗菌活性。此外，Basile等[14]從傘形花科類植物Ferulagocampestris的根中分離并鑒定了含量最豐富的三種吡喃香豆素類化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)agasyllin及其水解產(chǎn)物aegelinol對金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、陰溝腸桿菌的抗菌活性較好。

2 香豆素類化合物的抗菌作用靶點(diǎn)

以往認(rèn)為，香豆素類化合物的抗菌活性主要與細(xì)菌DNA回旋酶有關(guān)。目前認(rèn)為，香豆素類化合物的抗菌活性還與群體感應(yīng)系統(tǒng)、青霉素結(jié)合蛋白等有關(guān)。

2.1 競爭性抑制回旋酶的ATP酶活性 細(xì)菌回旋酶是細(xì)菌特有的一種酶，屬于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，是由A亞基(GyrA)和B亞基(GyrB)組成的異二聚體，分別由GyrA和GyrB基因編碼。GyrB能與ATP結(jié)合水解ATP，GyrA利用ATP水解的能量將共價閉合環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋DNA，從而維持細(xì)菌體內(nèi)正常的超螺旋結(jié)構(gòu)。關(guān)于香豆素類化合物對細(xì)菌回旋酶的作用最早見于新生霉素抗菌機(jī)制的研究。新生霉素能與ATP競爭性地結(jié)合到回旋酶的B亞基，從而使DNA回旋酶失去能量來源而失活。之后有研究發(fā)現(xiàn)，香豆素類化合物與DNA回旋酶的結(jié)合位點(diǎn)是在GyrB的N端，新生霉素的結(jié)合位點(diǎn)和ATP的結(jié)合位點(diǎn)有部分重疊，其中新生霉素的維諾糖部分和ATP的腺嘌呤環(huán)與DNA回旋酶的相互作用方式相似。表明香豆素類化合物并非簡單地作為回旋酶的競爭性抑制劑，其結(jié)合后可使酶的構(gòu)象和ATP親和力降低，從而抑制回旋酶的活性[15]。但目前該過程的精確調(diào)控模式尚不完全清楚。

新生霉素在臨床使用中易產(chǎn)生耐藥性，對其耐藥機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)菌具有高度抗性的突變主要發(fā)生在回旋酶的GyrB上，特別是Arg-136位點(diǎn)，但對酶的活性影響并不明顯。表明Arg-136殘基在新生霉素與回旋酶結(jié)合過程中具有重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的突變對香豆素類抗菌藥物庫馬霉素的耐藥程度較低。提示不同香豆素類化合物與回旋酶的結(jié)合模式并不相同，這可能是由于香豆素類化合物酰基、脫氧糖基和氨基香豆素基團(tuán)等主要藥效基團(tuán)之間的差異所致[16]。

目前普遍認(rèn)為，喹諾酮類化合物主要是抑制DNA-酶復(fù)合物的形成，香豆素類化合物主要是抑制ATP水解和超螺旋反應(yīng)的偶聯(lián)。但Flatman等[17]研究發(fā)現(xiàn)，香豆素類化合物Simocyclinone D8(SD8)雖然含有和新生霉素、香豆霉素等相同的關(guān)鍵特征氨基香豆素基團(tuán)，但SD8和已知的氨基香豆素類和喹諾酮類的機(jī)制均不同，主要通過阻止DNA回旋酶與DNA結(jié)合的早期步驟來發(fā)揮抗菌作用。提示不同取代基對香豆素類化合物與回旋酶的結(jié)合模式有著重要影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，香豆霉素A和氯香豆霉素等經(jīng)典的氨基香豆素類抗菌藥物以及多種香豆素類化合物與細(xì)菌回旋酶均有極高的親和力，可作用于回旋酶抑制細(xì)菌DNA的復(fù)制。如Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，秦皮素會增加細(xì)胞膜的通透性，能夠阻斷DNA回旋酶與DNA的結(jié)合來干擾核酸和蛋白的合成。

2.2 抑制群體感應(yīng)系統(tǒng) 細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌間信息傳遞的重要機(jī)制，細(xì)菌通過合成、分泌自誘導(dǎo)分子(AI)來控制整個細(xì)菌群體行為。當(dāng)胞外AI濃度達(dá)到一個臨界濃度時，AI能啟動細(xì)菌體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)菌產(chǎn)生毒素、形成生物膜等生物學(xué)行為，使細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的變化。革蘭陰性細(xì)菌和陽性細(xì)菌的AI有所不同。革蘭陰性菌常利用高絲氨酸內(nèi)酯類物質(zhì)(AHL)作為AI信號分子，而革蘭陽性菌則多利用小分子多肽(AIP)作為AI信號分子。另外，在革蘭陰性菌與革蘭陽性菌均存在一種自誘導(dǎo)物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是呋喃酮酰硼酸二酯[19，20]。

目前，人們已把尋找細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)拮抗藥物聚焦到植物。在具有抗菌活性的天然藥物庫中，Lee等[21]評價了9種香豆素類化合物對大腸埃希菌O157：H7的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)傘形酮能夠抑制細(xì)菌生物膜形成80%以上，而不影響細(xì)菌生長；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該類香豆素類化合物能抑制細(xì)菌curli菌毛基因和運(yùn)動基因的轉(zhuǎn)錄，這與觀察到的鞭毛數(shù)量減少、泳動減弱以及生物膜形成減少等現(xiàn)象一致。有研究亦發(fā)現(xiàn)，呋喃酮衍生物可作為銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)信號拮抗劑，被呋喃酮衍生物所抑制的基因中約80%為群體感應(yīng)系統(tǒng)所調(diào)節(jié)，包括編碼多藥外排泵和毒力因子等基因。在瑞香素、七葉亭、花椒毒酚和傘形花內(nèi)酯對青枯雷爾菌抗菌活性研究中發(fā)現(xiàn)，這些化合物均能抑制青枯雷爾菌增殖；透射電子顯微鏡和熒光顯微鏡下可見，該類化合物可破壞病原體的細(xì)胞膜，抑制生物膜的形成[22]。在銅綠假單胞菌中，天然香豆素類化合物可拮抗不同長度的AHL對細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的激活，抑制關(guān)鍵毒力因子的釋放和生物膜的形成[23]。香豆素類化合物可通過抑制細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，減少相關(guān)毒力因子的表達(dá)和生物膜的形成，從而降低細(xì)菌的致病性和耐藥性。隨著人們對香豆素類化合物作為群體感應(yīng)系統(tǒng)拮抗劑研究的逐步深入，該類化合物有可能成為一種新型抗菌藥物。

3.3 其他機(jī)制 由于香豆素類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，其抗菌譜和抗菌活性差異較大。對香豆素類化合物抗菌靶點(diǎn)的研究除了細(xì)菌DNA回旋酶和群體感應(yīng)系統(tǒng)外，還發(fā)現(xiàn)存在其他的抗菌機(jī)制，這可能與香豆素類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性有關(guān)，也可能與細(xì)菌種類有關(guān)。de Araujo等[24]研究發(fā)現(xiàn)，香豆素類化合物與四環(huán)素或氟哌酸合用后可使四環(huán)素或氟哌酸抗MRSA的MIC降低50.0%～87.5%。香豆素的非極性基團(tuán)是發(fā)揮協(xié)同抗菌作用的重要因素，當(dāng)香豆素類化合物與MRSA青霉素結(jié)合蛋白(PBP)分子對接時，所需結(jié)合能量較低，推測該類化合物是PBP的強(qiáng)效抑制劑。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，4-羥基香豆素化合物對MRSA和表皮葡萄球菌等均有較好的抗菌活性，其中香豆素環(huán)上的羥基對抗菌活性非常重要[25]；掃描電鏡和透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，該類化合物基本不影響細(xì)菌的正常形態(tài)，但可明顯抑制細(xì)菌擬核區(qū)遺傳物質(zhì)的合成；體外研究發(fā)現(xiàn)，其抗菌活性可能與抑制細(xì)菌DNA聚合酶功能有關(guān)。在大腸埃希菌中，參與應(yīng)急反應(yīng)的蛋白RecA通過刺激LexA的分解，誘導(dǎo)四十多種基因表達(dá)的SOS調(diào)控系統(tǒng)，而香豆素類化合物能通過阻遏氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)激活的RecA來降低耐藥的產(chǎn)生[26]。Lama等[27]利用香豆素類化合物amicoumacin A處理MRSA后，發(fā)現(xiàn)其能使MRSA的細(xì)胞膜能量耗散，而MRSA會通過減少蛋白合成、DNA擴(kuò)增等胞內(nèi)代謝代償性地改變來應(yīng)對細(xì)胞膜的功能紊亂，從而增加其存活率。

綜上所述，天然香豆素類化合物由于其衍生物種類繁多，其抗菌活性和機(jī)制亦不盡相同。深入研究香豆素類化合物的作用靶點(diǎn)和抗菌機(jī)制，將為耐藥菌感染治療提供了一種新策略，亦為抗菌藥物研制提供了一個新方向。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573468)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程(2014KTCL03- 03)。

李明凱(E-mail： mingkai@fmmu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.033

R285.6

A

1002- 266X(2017)28- 0102- 04

2016-10- 08)