劉旭東，李靜 ，柳太云

(1遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省人民醫(yī)院)

羥基酪醇對(duì)H2O2損傷的神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12凋亡影響及其機(jī)制

劉旭東1，李靜1，柳太云2

(1遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省人民醫(yī)院)

目的觀察羥基酪醇對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)損傷的神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法將第5代對(duì)數(shù)期PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組、觀察組進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)照組不加H2O2和羥基酪醇，H2O2組加H2O2，觀察組加H2O2及羥基酪醇。細(xì)胞培養(yǎng)24 h，采用CCK8比色法測(cè)算各組細(xì)胞存活率，同時(shí)測(cè)定各組細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)和ROS，Hoechst 33258 熒光染色法測(cè)算細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA，免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)各組NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白 ，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定各組IL-1β和TNF-α。結(jié)果與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞存活率降低(Plt;0.05)、細(xì)胞凋亡率上升(Plt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組細(xì)胞存活率上升(Plt;0.05)、細(xì)胞凋亡率降低(Plt;0.05)。與對(duì)照組相比，H2O2組LDH釋放率和ROS水平升高(P均lt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組LDH釋放率和ROS水平降低(P均lt;0.05)。與對(duì)照組相比，H2O2組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(Plt;0.05)、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(Plt;0.05)、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(Plt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(Plt;0.05)、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(Plt;0.05)、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(Plt;0.05)。與對(duì)照組相比，H2O2組NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白表達(dá)量增加(P均lt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白表達(dá)量減少(P均lt;0.05)。與對(duì)照組相比，H2O2組TNF-α和IL-1β的水平升高(P均lt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組TNF-α和IL-1β的水平降低(P均lt;0.05)。結(jié)論羥基酪醇可抑制H2O2損傷的PC12細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制是防止LDH從細(xì)胞中釋放并清除ROS、反向調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，同時(shí)減少炎癥靶蛋白和炎癥因子的表達(dá)。

羥基酪醇；PC12細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞；嗜鉻細(xì)胞瘤；細(xì)胞凋亡；凋亡基因；乳酸脫氫酶；活性氧簇；炎癥因子

活性氧簇(ROS)是氧分子的部分還原代謝產(chǎn)物的總稱，具有很高的生物活性，作為第二信使，它們?cè)诙喾N細(xì)胞因子生物活性的啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[1，2]。氧化應(yīng)激參與許多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的病理進(jìn)程，包括阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓氏病[3]。ROS引起生物大分子的不可逆損害是氧化應(yīng)激的主要結(jié)果[4]。特級(jí)初榨橄欖油是地中海飲食的核心。流行病學(xué)研究[5～7]表明堅(jiān)持地中海飲食可能降低年齡依賴性神經(jīng)變性的風(fēng)險(xiǎn)，特別是老年癡呆癥。橄欖油中的酚類化合物——羥基酪醇是一種天然抗氧化劑，能有效清除各種自由基[8，9]、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10，11]和保護(hù)心血管[12，13]。相比其他自由基清除劑，如維生素E、2,6-二叔丁基對(duì)甲苯酚或白藜蘆醇，羥基酪醇表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力[14～16]。有證據(jù)表明，羥基酪醇也可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，例如，從喂養(yǎng)羥基酪醇的小鼠的腦組織中發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶(LDA)呈羥基酪醇劑量依賴性降低，表明羥基酪醇對(duì)嚙齒動(dòng)物神經(jīng)具有保護(hù)作用[17]。此外，羥基酪醇可顯著減輕過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的DNA損傷[18]。2015年5月1日～2017年3月30日，我們觀察了羥基酪醇對(duì)H2O2損傷的神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12凋亡的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 來(lái)源于嗜鉻細(xì)胞瘤的神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞。羥基酪醇，RPMI1640和FBS，抗生素和抗真菌溶液，NF-κB和p-NF-κB Ser536抗體，CCK8，LDH和ROS檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒。本研究所用引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞加入含10% FBS、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)基1次。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上，用0.25%胰酶/0.1% EDTA消化，1 000 r/min離心5 min，按1∶3傳代培養(yǎng)。將第5代對(duì)數(shù)期PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組、觀察組進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組不加H2O2和羥基酪醇，H2O2組加200 μmol/L的H2O2，觀察組加200 μmol/L的H2O2及25、50、100 μmol/L 的羥基酪醇 。

1.2.2 細(xì)胞存活率測(cè)算 采用CCK8比色法。 上述三組細(xì)胞(接種于96 孔培養(yǎng)板)培養(yǎng)24 h后，吸去上清，按照說(shuō)明書(shū)每孔加入 CCK8 溶液10 μL及培養(yǎng)基100 μL， 并設(shè)置空白對(duì)照組(只有培養(yǎng)基100 μL和CCK溶液10 μL而沒(méi)有細(xì)胞)37 ℃避光孵育1 h。酶標(biāo)儀上測(cè)定樣本450 nm的光密度值(OD值)。計(jì)算細(xì)胞存活率， 細(xì)胞存活率=[(OD值觀察組或H2O2組-OD值空白對(duì)照組)/(OD值對(duì)照組- OD值空白對(duì)照組)]×100%。將對(duì)照組的細(xì)胞存活率定義為100%。

1.2.3 細(xì)胞LDH釋放率測(cè)算 上述三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別收集各組細(xì)胞上清液；同時(shí)消化收集各組PC12細(xì)胞并加入0.2%的Triton X-100裂解細(xì)胞，4 ℃、10 000 g 離心2 min ，收集上清。按照LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處OD值(細(xì)胞上清液中檢測(cè)的OD值代表胞外OD值，細(xì)胞裂解液中檢測(cè)的OD值代表胞內(nèi)OD值)。計(jì)算LDH釋放率，LDH釋放率=[胞外OD值/(胞外OD值+胞內(nèi)OD值)]×100% 。

1.2.4 細(xì)胞ROS測(cè)定 上述三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別加2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)10μmol/L，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次。收集細(xì)胞并用PBS重懸，加入96孔板，按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)各組二氯熒光素(DCF)[DCFH-DA是一種可自由穿過(guò)細(xì)胞膜的無(wú)熒光物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)的酯酶可將其水解生成不能通透細(xì)胞膜的二氯熒光黃(DCFH)，細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠?qū)CFH氧化生成DCF，DCF可以發(fā)出熒光，檢測(cè)其熒光強(qiáng)弱能夠反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平]，將檢測(cè)到的DCF的熒光強(qiáng)度換算成百分比，并以此表示ROS水平。

1.2.5 凋亡細(xì)胞檢測(cè) 采用Hoechst 33258染色法。上述三組細(xì)胞(以1×108/L接種于6孔培養(yǎng)板)培養(yǎng)24 h后，用3.7%的多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS洗滌3次(每次1 min)，用Hoechst 33258處理30 min，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.6 細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。上述三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，TRIzol抽提總RNA，分光光度計(jì)測(cè)RNA純度及濃度后用Revert Aid First Strand cDNA synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR green染色法，以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進(jìn)行PCR，各樣本重復(fù)3次；反應(yīng)條件：95 ℃變性2 min,以后每個(gè)循環(huán)條件為95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循環(huán)40次。Bax的上游引物為5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，下游引物為5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′；Bcl-2的上游引物為5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游引物為5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′；Caspase-3的上游引物為5′-GACAACAACGAAACCTCCG-3′，下游引物為5′-ATCTTCCTTAGAAACACTATCCAT-3′；β-actin的上游引物物為5′-ACTCGTCATACTCCTGCT-3′，下游引物為5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示 。

1.2.7 細(xì)胞NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。上述三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用冷PBS洗滌2次，RARI裂解細(xì)胞,離心并收集上清后檢測(cè)NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白，采用10% SDS-PAGE凝膠膠電泳，用 Quantity One軟件分析目的條帶的灰度值。

1.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α、IL-1β檢測(cè) 上述三組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別將培養(yǎng)基收集入微量離心管，離心10 min，將上清液分離出來(lái)，用ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-1β。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 加入25、50、100 μmol/L羥基酪醇的觀察組細(xì)胞存活率分別為66.3%、75.9%、83.4%，H2O2組為58.6%，對(duì)照組為100%；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.05；觀察組與H2O2組相比，P均lt;0.05；觀察組細(xì)胞存活率隨羥基酪醇劑量增加而升高(組間相比，P均lt;0.05)。

2.2 各組LDH釋放率和ROS水平比較 加入25、50、100 μmol/L 羥基酪醇的觀察組LDH釋放率分別為180.6%±5.9%、145.7%±7.6%、115.2%±5.5%，H2O2組為203.1%±5.1%，對(duì)照組為100.0%±3.9%；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.05；觀察組與H2O2組相比，P均lt;0.05；觀察組LDH釋放率隨羥基酪醇劑量增加而降低(組間相比，P均lt;0.05)。

加入25、50、100 μmol/L 羥基酪醇的觀察組ROS水平分別為176.4%±5.6%、142.4%±4.3%、108.8%±2.6%，H2O2組為219.6%±2.8%，對(duì)照組為81.3%±2.1%；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.05；觀察組與H2O2組相比，P均lt;0.05；觀察組ROS水平隨羥基酪醇劑量增加而降低(組間相比，P均lt;0.05)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率及Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較 100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為38.02%±1.97%、63.99%±4.69%、5.26%±1.12%；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.05；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.05。

100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對(duì)照組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.16±0.08、1.70±0.23、1.00±0.03；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對(duì)照組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.83±0.03、0.62±0.14、1.00±0.05；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對(duì)照組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.15±0.04、2.03±0.01、1.00±0.02；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。

2.4 各組細(xì)胞NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白表達(dá)比較 100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對(duì)照組NF-κB蛋白灰度值分別為1.34±0.01、2.70±0.08、1.00±0.07；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.05。100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對(duì)照組p-NF-κB Ser536蛋白灰度值分別為1.15±0.07、2.03±0.01、1.00±0.03；H2O2組與對(duì)照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。

2.5 各組TNF-α和IL-1β表達(dá)比較 100 μmol/L羥基酪醇觀察組、H2O2組、對(duì)照組TNF-α表達(dá)量分別為(140.5±9.7)、 (230.3±10.5)、(10.7±2.3) pg/mL，IL-1β表達(dá)量分別為 (260.3±26.2)、(610.5±20.6)、(71.2±15.3)pg/mL；H2O2組與對(duì)照組相比，P均lt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。

3 討論

羥基酪醇是橄欖油主要有效成分，可減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，羥基酪醇可抑制H2O2損傷的PC12細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激參與腦缺血和中風(fēng)的病理生理過(guò)程[19]。ROS的積累可能導(dǎo)致各種形式的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA氧化，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[20]。本研究結(jié)果顯示，200 μmol/L的H2O2能夠顯著刺激PC12細(xì)胞ROS的積累和LDH釋放；加入羥基酪醇后，其以劑量依賴的方式降低ROS的產(chǎn)生并抑制LDH漏出。這些結(jié)果表明，羥基酪醇減輕了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和氧化損傷，阻止細(xì)胞凋亡。

ROS被認(rèn)為是細(xì)胞存活、增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)[21，22]。Bcl-2蛋白家族包括Bax和Bcl-2，與ROS引起的細(xì)胞凋亡相關(guān)。ROS還可以激活Caspase-3引起參與DNA修復(fù)的聚合酶PARP的裂解。本研究發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞細(xì)胞凋亡，而且細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)增加、Bcl-2 mRNA表達(dá)下降、Caspase-3 mRNA表達(dá)增加。而100 μmol/L的羥基酪醇干預(yù)后PC12細(xì)胞凋亡程度有所降低，而且Bax mRNA表達(dá)下降、Bcl-2 mRNA表達(dá)增加、Caspase-3 mRNA表達(dá)下降。這一結(jié)果表明，羥基酪醇通過(guò)對(duì)PC12細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)而阻止細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是引起神經(jīng)損傷和相關(guān)疾病的一個(gè)重要因素。研究[23，24]表明，慢性炎癥涉及神經(jīng)變性疾病和細(xì)胞損傷。許多炎癥靶蛋白，包括MMP-9、COX-2、iNOS和某些黏附分子的產(chǎn)生與ROS密切相關(guān)[25，26]。NF-κB通過(guò)調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)后，PC12細(xì)胞中NF-κB和其活性形式p-NF-κB(Ser536)表達(dá)增加，同樣TNF-α和IL-1β的表達(dá)也顯著增加。而加入100 μmol/L羥基酪醇后，NF-κB、p-NF-κB(Ser536)、TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平均降低。這表明羥基酪醇還能校正H2O2誘導(dǎo)的異常炎癥信號(hào)通路。

綜上所述， 羥基酪醇可抑制H2O2損傷的PC12細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制是防止LDH從細(xì)胞中釋放并清除ROS，反向調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，同時(shí)減少炎癥靶蛋白和炎癥因子的表達(dá)。推測(cè)羥基酪醇可以作為抗氧化應(yīng)激保護(hù)劑和細(xì)胞內(nèi)ROS的清除劑，有可能成為治療缺血性腦損傷的一種新的藥物。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.012

R363

A

1002-266X(2017)43-0038-04

柳太云(E-mail: 515385437@163.com)

2017-06-23)