李樹江 楊友聯(lián)

（1六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水553001；2六盤水市生物研究所，貴州六盤水553001）

毛慈菇Cremastra appendiculata(D.Don)Makino為蘭科杜鵑蘭屬多年生草本植物杜鵑蘭的習(xí)稱，主要分布于我國陜西、四川、貴州等省，其與獨蒜蘭、云南獨蒜蘭統(tǒng)稱山慈菇，被收錄入中國藥典，具有清熱解毒、化痰散結(jié)等功效，用于癰腫疔毒，瘰疬痰核，蛇蟲咬傷和癥瘕痞塊(國家藥典委員會，2015)?，F(xiàn)代藥理研究表明，毛慈菇具有抗腫瘤活性，對結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等多種癌細胞具有非選擇性細胞毒性（夏文斌等，2005），在臨床上通常作為抗癌中藥配伍使用（中國中醫(yī)藥管理局，1999）。近年來，為滿足市場需求，在貴州貴陽、黔東南等地開始了人工保育或栽培。在調(diào)查貴州省中藥真菌病害過程中，發(fā)現(xiàn)其葉片出現(xiàn)近圓形至不規(guī)則形灰褐色至黑褐色枯斑，影響了杜鵑蘭的生長。截至目前，未見毛慈菇病原真菌的相關(guān)報道，為弄清其病原菌，提高對該病害的防治效果，本研究采用多基因系統(tǒng)學(xué)對分離的病原菌進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 標本采集與病原菌分離

在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院杜鵑蘭保育基地，將發(fā)生枯斑的杜鵑蘭葉片采下，裝入信封，帶回室內(nèi)4℃暫存，采用常規(guī)組織塊分離法分離病原菌（方中達，1998）。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 病原菌的培養(yǎng)

采用PDA培養(yǎng)基觀察菌落特征和在水瓊脂培養(yǎng)基平板添加滅菌松針的方法誘導(dǎo)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（楊友聯(lián)等，2015）。PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成約1 cm2小塊，加自來水1 000 mL，大火煮沸后文火煮30 min，四層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂18 g，補足水1 000 mL，文火加熱至瓊脂完全熔化，pH自然，滅菌后備用。

1.2.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析

基因組DNA提取與檢測采用改良的CTAB法（Chen J等，2007）。擴增與測序的目的基因及引物為翻譯延伸因子1-α[elongationfactors1α，EF1-α；引物EF1-986R（5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’）和 EF1-728F（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGC-3’）（Carbone和Kohn,1999）]、核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列[internal Transcribed Spaces，ITS；引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和 ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）(White等,1990)]、核糖體大亞基基因[nuclear ribosomal large subunits gene,LSU；引物L(fēng)R0R（5’-ACCCGC TGAACTTAAGC-3’）和 LR5（5‘-TCCTGAGGGAA ACTTCG-3’）（Vilgalys和Hester,1990）]、核糖體小亞基基因[nuclear ribosomal small subunits gene,SSU；引物為NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’）和NS4（5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’）(White 等,1990)]、β-微 管 蛋 白 基 因 [β-tubulin gene,TUB2；引物 Bt2a（5’-GGTAACCAAATCGGT GCTGCTTTC-3’）和 Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAG TGACCCTTGGC-3’）(Glass和Donaldson,1995)]。

對自測的各個基因序列在GenBank比對，下載的相關(guān)的序列如表1，采用Paup*4.0 beta 10等軟件構(gòu)建多基因系統(tǒng)樹進行分析（楊友聯(lián)等2015）。

表1 參與系統(tǒng)學(xué)分析的序列Table 1 Taxa used in this study

2 實驗結(jié)果

2.1 分離菌株形態(tài)學(xué)特征

從葉枯病病斑分離得到菌株1株（菌株號：LPSU20120217）。菌株在PDA培養(yǎng)基上，25℃生長快速(15.2 mm/d)，菌落棉絮狀，中央白色到灰色、邊緣白色；背面污白色至黑色（圖1）；隨著培養(yǎng)時間延長，整個菌落正面及背面變?yōu)樯詈谏?/p>

菌株在人工培育條件下，在PDA培養(yǎng)基及水瓊脂松針上均未產(chǎn)生無性或有性孢子。

圖1 毛慈菇葉枯病病原菌菌落（菌株號：LPSU20120217）。A，正面；B，反面。Figure 1 culture of pathogeny causingCremastra appendiculataleaf blight(strain:LPSU20120217).A,upper;B,reverse.

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析

分離菌株的EF1-α、ITS、TUB2、LSU和SSU基因序列提交到GenBank的登錄號見表1。在基于多基因構(gòu)建的最大簡約系統(tǒng)樹中(圖2)，杜鵑蘭葉枯病病原菌與葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea(Moug.:Fr.)Ces.&De Not.的模式菌株（菌株號：CMW8000）聚為一支，支持率為74%，與B.fusispora的親緣關(guān)系最近。

圖2 基于翻譯延伸因子1α、核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列、核糖體大亞基、核糖體小亞基和β-微管蛋白基因部分序列，用Paup軟件，以Spencermartinsia viticola（菌株號CBS 117009）為外類群構(gòu)建的最大簡約系統(tǒng)樹。分支上的數(shù)值為1 000次重復(fù)后的高于50%以上的Bootstrap值。T，模式菌株或詮釋模式菌株。Figure 2 Maximum parsimony phylograms EF1-α,inferred from combined partial ΙTS,SSU,LSU,and β-tublin sequences data,showing phylogenetic relationships of strain 20120127 isolated from Cremastra appendiculata and selected sequences of Botryosphaeriaceae species.Values above the branches are parsimony bootstrap(equal or above 50%).The tree is rooted with Spencermartinsia viticola(CBS 117009).T,ex-type or ex-epitype.

根據(jù)菌落特征和分子系統(tǒng)學(xué)分析，引起杜鵑蘭葉枯病的病原菌為葡萄座腔菌屬葡萄座腔菌[Botryosphaeria dothidea(Moug.:Fr.)Ces.&De Not]。

3 討論

葡萄座腔菌廣泛分布于熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)，是一種危害嚴重的病原真菌，可引起166屬約314種植物病害（Farr&Rossman,2015），可危害植物葉、幼枝、莖及果實，引起潰瘍、枯萎、頂枯、葉斑、果實腐爛等。在國內(nèi)，已引起棗樹等干腐?。ㄚw曉軍等，2009）、山核桃、毛梾木、葡萄、桉樹、煙草、中華青莢葉等多種林木潰瘍病（Yu,L.等,2009；Zhang,C.Q 等，2011；Yu,L.等，2012;Yan,J.等，2012；Zhang,Z.X.等，2013；Bian，C.H.等，2015），桉樹、藍莓枯萎病(Yu,L.等，2009；Yu,L.等，2012)、中華青莢葉、葡萄頂枯病和灰氈毛忍冬(Yu,L.等，2012;楊友聯(lián) 等，2014;Yan,J.Y.等，2013)；蘋果輪紋病(Tang,W.等，2012;Xu,C.等，2015)，杧果、獼猴桃、石榴等果腐病(Ni,H.F.等,2010;Zhou,Y.等,2015;付娟妮 等，2007)以及桃樹流膠病等(Wang,F.等，2011)，主要危害木本植物莖或枝及果實，鮮有危害葉引起葉枯病的報道。在本研究樣品采集地附近500 m范圍內(nèi)有蘋果樹、桃樹等分布，稍遠還有葡萄園分布，鑒于葡萄座腔菌寄主的廣泛性，建議在預(yù)防該菌引起的毛慈菇葉枯病時，亦注意周圍樹木的潰瘍、頂枯病等病害防治。

葡萄座腔菌屬真菌在自然基質(zhì)及人工培育條件下不易產(chǎn)生無性或有性型繁殖結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)基上因生長迅速(一般4～5 d長滿9 cm平板)且菌落隨著培養(yǎng)時間延長由白色逐漸變成黑色而較易識別到屬，但僅憑菌落特征，種的鑒定極為困難。少部分種或菌株雖然在水瓊脂松針上長時間誘導(dǎo)培養(yǎng)可產(chǎn)生無性型，但歷時長，多數(shù)種或菌株的誘導(dǎo)徒勞無果。即便在自然基質(zhì)或人工誘導(dǎo)下產(chǎn)生子實體，憑借形態(tài)學(xué)方法種間區(qū)分甚微，常常導(dǎo)致有爭議的結(jié)論。故目前對該類群的病原菌鑒定往往采用分子系統(tǒng)學(xué)分析方法，而在分子生物學(xué)鑒定中單基因分子系統(tǒng)學(xué)亦不易明顯區(qū)分近緣種，甚至部分近緣種采用多基因也難以顯著區(qū)分，如在基于延伸因子-1α、核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列、β-微管蛋白、核糖體大亞基、核糖體小亞基等5個基因構(gòu)建的多基因系統(tǒng)樹中，不能將Botryosphaeria fusisporaBoonmee，J.K.Liu&K.D.Hyde和B.dothidea這2個種很好地區(qū)分開（支持率低于50%）(Liu J K等,2012)，故對葡萄座腔菌屬病原真菌進行鑒定時，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)顯微特征、菌落特征以及多基因分子系統(tǒng)學(xué)綜合分析，提高鑒定的可靠性。

參考文獻:

方中達.1998.植病研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,210.

付娟妮,劉興華,蔡福帶,等.2007.石榴采后腐爛病病原菌的分子鑒定[J].園藝學(xué)報,34(4):877-882.

國家藥典委員會.2015.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,32-33.

夏文斌,薛震,李帥,等.2005.杜鵑蘭化學(xué)成分及腫瘤細胞毒活性研究[J].中國中藥雜志,30(23):1827-1829.

楊友聯(lián),李樹江,胡海雪,等.2014.灰氈毛忍冬頂枯病病原菌的分子鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,28(5):2107-2111.

趙曉軍,周建波,趙子俊,等.2009.棗樹干腐病病原菌的鑒定[J].菌物學(xué)報,28(3):332-335.

中國中醫(yī)藥管理局.1999.中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,7828.

Bian,C.H.,Miao,P.,and Kang,Y.B.2015.First report of canker disease of flue-cured tobacco caused byBotryosphaeria dothideain China[J].China.Plant Disease,99:890.

Carbone,Ι.,and Kohn,L.M.1999.A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes.Mycologia 99:553-556.

Chen J,Xu L L,Liu B,et al.2007.Taxonomy ofDactylellacomplex andVermispora.Ι.Generic concepts based on morphology and ΙTS sequences data[J].Fungal Diversity,26:73-83.

Farr D F,Rossman,AY.2015.Fungal Databases,Systematic Mycology and Microbiology Laboratory,ARS,USDA.Retrieved September 9,from http://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases.

Glass N L,Donaldson G C.1995.Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes[J].Applied and Environmental Microbiology,61:1323.

Liu J K,Phookamsak R,Doilom M,et al.2012.Towards a natural classification of Botryosphaeriales[J].Fungal Diversity,57:149-210.

Ni,H.F.,Liou,R.F.,Hung,T.H.,Chen,R.S.,and Yang,H.R.2010.First report of fruit rot disease of mango caused byBotryosphaeria dothideaandNeofusicoccum mangiferaein Taiwan[J].Plant Disease,94:128.(43965).

Tang,W.,Ding,Z.,Zhou,Z.Q.,Wang,Y.Z.,and Guo,L.Y.2012.Phylogenetic and Pathogenic Analyses Show That the Causal Agent ofApple Ring Rot in China isBotryosphaeria dothidea[J].Plant Disease,96:486-496.

Vilgalys R,Hester M.1990.Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species[J].Journal of Bacteriology,172:4238-4246.

Wang,F.,Zhao,L.,Li,G.,Huang,J.,and Hsiang,T.2011.Identification and characterization of Botryosphaeria spp.casuing gummosis of peach trees in Hubei Province,central China[J].Plant Disease,95:1378-1384.(45290).

White T,Bruns T,Lee S,et al.1990.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].In:PCR protocols:a guide to methods and applications(eds.Innis M A,Gelfand D H,Sninsky J,et al.),Academic Press,San Diego:18:315-322.

Xu,C.,Wang,C.,Ju,L.,Zhang,R.,Biggs,A.R.,Tanaka,E.,Li,B.,and Sun,G.2015.Multiple locus genealogies and phenotypic characters reappraise the causal agents of apple ring rot in China[J].Fungal Diversity,71:215-231.

Yan,J.,Xie,Y.,Yao,S.-W.,Wang,Z.,and Li,X.2012.Characterization ofBotryosphaeria dothidea,the casual agent of grapevine canker in China[J].Australasian Plant Pathology,41:351-357.(46248).

Yan,J.Y.,Xie,Y.,Zhang,W.,Wang,Y.,Liu,J.K.,Hyde,K.D.,Seem,R.C.,Zhang,G.-Z.,Wang,Z.-Y.,Yao,S.-W.,and Dissanayake,A.J.2013.Species ofBotryosphaeriaceaeinvolved in grapevine dieback in China[J].Fungal Diversity,61:221-236.

Yu,L.,Chen,X.L.,Gao,L.L.,Chen,H.R.,and Huang,Q.2009.First report ofBotryosphaeria dothideacausing canker and shoot blight of Eucalyptus in China[J].Plant Disease,93:764.

Yu,L.,Rarisara,I.,Xu,S.G.,Wu,X.,and Zhao,J.R.2012.First Report of Stem Blight of Blueberry Caused byBotryosphaeriadothidea in China[J].Plant Disease,96:1697.

Yu,L.,Wang,L.F.,Zhao,J.R.,Xu,S.G.,Gao,D.,and Zheng,J.F.2012.First Report of Botryosphaeria dothidea Causing Canker and Dieback Disease of Helwingia chinensis in China[J].Plant Disease,96:1821.

Zhang,C.Q.,and Xu,B.C.2011.First report of canker on pecan(Carya cathayensis)caused byBotryosphaeria dothideain China[J].Plant Disease,95:1319.

Zhang,Z.X.,Deng,D.F.,Qi,W.J.,Fan,S.S.,Cao,Y.,Huang,J.G.,and Liu,Z.Y.2013.Botryosphaeria dothidea,the causal agent of a new stem canker disease of Tatarian dogwood(Cornus alba)in China[J].Australasian Plant Pathology,42:113-119.

Zhou,Y.,Gong,G.,Cui,Y.,Zhang,D.,Chang,X.,Hu,R.,Liu,N.,and Sun,X.2015.Identification ofBotryosphaeriaceaespecies causing kiwifruit rot in Sichuan Province,China[J].Plant Disease,99:699-708.(47799)