魏偉，楊波，唐翎

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.普通外科 3.藥劑科，湖南 長沙 410008；2.湖南省常德市第四人民醫(yī)院 普通外科，湖南 常德415000）

胰腺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其病因和發(fā)病的分子機(jī)制尚不明確[1-4]。近年來，癌基因或抑癌基因變異引起的相關(guān)功能因子的表達(dá)紊亂而導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生發(fā)展的基因功能研究是胰腺癌病因和發(fā)病分子機(jī)制研究的重要方向[5-8]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA分子，它可在多層面上，包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)方面調(diào)控基因的表達(dá)[9]。近年來有研究[10-15]表明，lncRNA亦可作為原癌基因或抑癌基因參與腫瘤的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移過程，如MALAT1、HOTAIR、HNF1A-AS及XIST等。據(jù)報(bào)道[16]，X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本（X-inactive specific transcript，XIST）在多種癌癥中均呈高表達(dá)，且XIST的高表達(dá)往往與癌癥預(yù)后不良有密切關(guān)系。Fang等[17]研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中，XIST扮演了癌基因的角色。

本研究將檢測(cè)胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系中XIST的表達(dá)水平，并通過siRNA干擾胰腺癌細(xì)胞中XIST表達(dá)后檢測(cè)其增殖的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE、人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-3、BxPC-3、Capan-1、CFPAC-1、Hs766T、Panc-1及SW1990購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。XIST siRNA套裝購自上海吉瑪生物；MTT檢測(cè)試劑盒和BrdU檢測(cè)試劑盒購自贏潤生物技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑lipo-2000購自美國Life Technology公司；總RNA提取試劑（RNA Lyz01）購自依科賽生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT reagent Kit）購自TaKaRa公司；熒光定量PCR試劑購自Bio-Rad公司；改良Eagle培養(yǎng)基高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；Ki-67、PCNA抗體購自Abcam公司；其它常用試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 組織樣品收集

56對(duì)正常胰腺組織和胰腺癌組織標(biāo)本由本科室2013—2015年收集，所有病例術(shù)前均未行放療、化療。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HDPE、Capan-1、Hs766T、Panc-1在含10%胎牛血清的DMEM（Gibco，Carlsbad，CA）培養(yǎng)基中培養(yǎng)；AsPC-1、BxPC-3、SW1990細(xì)胞系在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；CFPAC-1在含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

制備終濃度為80 nmol/L的XIST siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)組加入XIST siRNA，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。將人胰腺癌 SW1990細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板，待細(xì)胞增殖至70%～80%時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，采用Lipo-2000 將XIST siRNA1、siRNA2、siRNA3分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

收集各組細(xì)胞，每孔不少于1×106個(gè)細(xì)胞制備總RNA并定量；取5 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，然后以cDNA為模板、GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s 預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用BIO-RAD real-time PCR儀自帶軟件分析PCR過程中樣本的循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），采用2-AACT計(jì)算各組細(xì)胞中目的基因相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。GAPDH引物序列正向:5'-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3'；反向:5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'。XIST引物序列為正向:5'-ACG CTG CAT GTG TCC TTA G-3'；反向:5'-GAG CCT CTT ATA GCT GTT TG-3'。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞生長曲線

收集各組處于對(duì)數(shù)生長期的胰腺癌SW1990細(xì)胞，把細(xì)胞懸液濃度調(diào)節(jié)為1×105/mL。將100 μL（含1×104個(gè)細(xì)胞）的細(xì)胞懸液種入每孔中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，種5塊96孔板。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，把種板時(shí)間作為起始時(shí)間點(diǎn)0 h，在1 h取出一塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1 000 r/min離心10 min，小心吸掉孔內(nèi)上清液，每孔均加入100 μL二甲基亞砜，將9 6孔板置搖床上，低速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上波長490 nm處分別測(cè)量各孔的吸光度（A）。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（MTT、培養(yǎng)基、二甲基亞砜）。此后每隔12 h取1塊培養(yǎng)板檢測(cè)490 nm的OD值，一共檢測(cè)72 h。

1.7 BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

細(xì)胞以2×103/mL細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，培養(yǎng)1 d，用含0.4%FCS培養(yǎng)液同步化2 d，使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期。終止細(xì)胞培養(yǎng)前，加入BrdU（終濃度為10 μmol/L），37 ℃，孵育24 h。去除培養(yǎng)基，細(xì)胞被固定30 min，過氧化物酶孵育耦合抗BrdU抗體（Sigma-Aldrich公司）孵育60 min，用PBS洗3次，加過氧化物酶底物（四甲基聯(lián)苯胺）染色30 min，在490 nm處測(cè)定各組的OD值。

1.8 Western blot檢測(cè)Ki-67、PCNA

收集各組細(xì)胞，每孔不少于1×106個(gè)細(xì)胞制備總蛋白，定量后按相同總量和濃度進(jìn)行SDSPAGE垂直電泳（1.5～2.5 h）；然后用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVC膜上（90 V，45～90 min），用5%的脫脂牛奶封閉；洗膜后分別孵育一抗，4 ℃孵育過夜后洗膜3次；孵育二抗，1～2 h后洗膜3次；制備化學(xué)發(fā)光試劑并滴加到含目的蛋白的膜上，暗室顯影或用成像系統(tǒng)直接采集圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 XIST在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)56對(duì)胰腺癌組織及正常組織中XIST的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:胰腺癌組織XIST的表達(dá)量明顯高于癌旁正常胰腺組織[（2.452±0.134）vs.（0.9729±0.035），P＜0.001]（圖1）。結(jié)合臨床指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出:XIST的高表達(dá)與胰腺癌腫瘤分期（P=0.016）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.032）有關(guān)（表1）。

圖1 XIST在胰腺癌組織及癌旁正常組織的表達(dá)Figure 1 XIST expression in pancreatic cancer and normal tissues

表1 XIST的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of XIST expression with clinicopathologic variables of pancreatic cancer patients [n (%)]

2.2 XIST在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

為了確定XIST在胰腺癌中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)中選取人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE作為對(duì)照，同時(shí)選擇7個(gè)胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-3、BxPC-3、Capan-1、CFPAC-1、Hs766T、Panc-1和SW1990為研究對(duì)象。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)8組細(xì)胞中XIST的表達(dá)水平，結(jié)果顯示:與HPDE細(xì)胞比較，XIST在7個(gè)胰腺癌細(xì)胞系中均呈高表達(dá)（均P＜0.05）；其中SW1990相比較于HPDE，XIST表達(dá)水平升高（2.510±0.170）倍（圖2）。

圖2 XIST在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞與不同胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 2 XIST expressions in pancreatic duct epithelial cells and diあerent pancreatic cancer cell lines

2.3 XIST有效siRNA序列篩選

實(shí)驗(yàn)選擇XIST高表達(dá)的SW1990細(xì)胞為后續(xù)研究工具細(xì)胞，并設(shè)計(jì)在SW1990細(xì)胞中沉默XIST。將合成的3個(gè)XIST siRNA序列分別轉(zhuǎn)染至SW1990細(xì)胞，根據(jù)siRNA產(chǎn)品使用手冊(cè)推薦，在轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)4組細(xì)胞中XIST mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示:siRNA2對(duì)XIST的RNA表達(dá)水平抑制最明顯，表達(dá)水平為0.247±0.021，抑制率達(dá)到75.3%（P＜0.01）（圖3），滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

圖3 XIST siRNA序列篩選結(jié)果Figure 3 Results of XIST siRNA screening

2.4 XIST調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖

研究應(yīng)用MTT法和BrdU法測(cè)定了XIST siRNA2轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系SW1990后細(xì)胞的活力和增殖水平的變化。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示:48 h對(duì)照組及沉默組OD（490nm）分別為1.215±0.048、0.812±0.024，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）。BrdU法檢測(cè)結(jié)果顯示:48 h對(duì)照組及沉默組OD（450 nm）分別為1.007±0.065、0.708±0.085，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖5）。

圖4 MTT檢測(cè)XIST沉默對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力的影響Figure 4 In fluence of XIST silencing on viability of pancreatic cancer cells detected by MTT assay

圖5 BrdU法檢測(cè)XIST沉默對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響Figure 5 Influence of XIST silencing on proliferation of pancreatic cancer cells detected by BrdU assay

2.5 XIST調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白

為進(jìn)一步驗(yàn)證XIST抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)在SW1990細(xì)胞中轉(zhuǎn)染XIST siRNA2，48 h后收集細(xì)胞應(yīng)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中與增殖相關(guān)基因Ki-67、PCNA的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示:在48 h對(duì)照組與XIST沉默組Ki-67的表達(dá)水平分別為1.027±0.074、0.467±0.055，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；在48 h對(duì)照組與XIST沉默組PCNA的表達(dá)水平分別為0.997±0.105、0.600±0.082，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖6）。結(jié)果從分子層面證明:在胰腺癌細(xì)胞中，沉默XIST后細(xì)胞增殖促進(jìn)因子Ki-67、PCNA表達(dá)被抑制，從而實(shí)現(xiàn)抑制癌細(xì)胞的增殖。

圖6 XIST沉默對(duì)胰腺癌細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)的影響Figure 6 In fluence of XIST silencing on Ki-67 and PCNA expressions in pancreatic cancer cells

3 討 論

據(jù)2014年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，發(fā)達(dá)國家（美國）胰腺癌新發(fā)估計(jì)病例數(shù)，男性列第10位，女性列第9位，占惡性腫瘤病死率的第4位。據(jù)《2013年中國腫瘤登記年報(bào)》統(tǒng)計(jì)，胰腺癌位列我國男性惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，人群惡性腫瘤病死率的第7位，全球范圍內(nèi)均呈快速上升趨勢(shì)。胰腺的腫瘤大多是外分泌型腫瘤，80%是胰腺導(dǎo)管腺瘤，只有2%的胰腺外分泌腫瘤為良性[18-20]。胰腺癌以高侵襲性和早期轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)，臨床癥狀出現(xiàn)晚，發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，很難施行治愈性的手術(shù)治療，預(yù)后較差。近幾年在我國發(fā)病率逐年上升，并且有年輕化的趨勢(shì)。雖然放療和化療對(duì)延長患者生存期起到了一定的作用，但是患者中位生存期仍小于2年[21]。由于胰腺癌的這些特性，尋找參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展，尤其是與胰腺癌早期診斷及預(yù)后相關(guān)的新的生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌并改善胰腺癌患者的預(yù)后具有重要意義。

XIST是雌性哺乳動(dòng)物X染色體的轉(zhuǎn)錄沉默所需的一個(gè)長非編碼RNA，它在X染色體失活過程中發(fā)揮重要作用。近年來，越來越多的證據(jù)[22-25]顯示XIST與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，XIST敲除通過減少細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)出抑制腫瘤發(fā)展的作用[22]。據(jù)Ma等[14-15]報(bào)道，在胃癌患者中，XIST高表達(dá)同更大的腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。

RT-PCR檢測(cè)分析本科室2013—2015年收集的56對(duì)正常胰腺組織和胰腺癌組織、人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及7個(gè)胰腺癌細(xì)胞系中XIST的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在胰腺癌組織和7個(gè)胰腺癌細(xì)胞系中，XIST均呈現(xiàn)高表達(dá)，在SW1990細(xì)胞系中表達(dá)升高尤其明顯；結(jié)合臨床資料分析顯示XIST的高表達(dá)可能與更差的胰腺癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與其他學(xué)者[14,26]研究結(jié)果一致。

利用RNA干擾技術(shù)在SW1990細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)XIST沉默，胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和增殖均被顯著抑制，說明XIST在胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系中的高表達(dá)可能與胰腺癌生長及胰腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)。XIST沉默后，胰腺癌細(xì)胞中Ki-67、PCNA的蛋白表達(dá)被顯著抑制，說明XIST可能通過調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中Ki-67、PCNA的蛋白表達(dá)來影響胰腺癌細(xì)胞增殖。Yue等[27]研究報(bào)道，胰腺癌組織及細(xì)胞系中，PCNA蛋白過表達(dá)可能有助于胰腺癌的發(fā)生或進(jìn)展；本研究結(jié)果表明XIST沉默可抑制PCNA蛋白表達(dá)，并可能通過抑制PCNA蛋白表達(dá)而影響胰腺癌細(xì)胞活力和增殖。以上結(jié)果表明XIST可能是胰腺癌惡性程度高，增殖快的原因之一。

綜上所述，深入了解XIST促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖及相關(guān)機(jī)制，可能為胰腺癌的診斷、病情監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有可能將其作為胰腺癌治療的新的作用靶點(diǎn)，對(duì)于指導(dǎo)治療、提高術(shù)后生存率有重要的意義。

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