魏彪，張建新，崔磊，瞿建國，錢小寶，黨勝春

（江蘇大學附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

近年來，胰腺癌的全球新發(fā)病例及死亡人數(shù)有明顯上升趨勢[1]，由于其癥狀不明顯而不易確診等原因，患者確診時多處于腫瘤晚期。據(jù)統(tǒng)計，胰腺癌患者5年生存率＜5%，早期即會發(fā)生周圍組織器官的侵犯或遠處轉移[2]。降低胰腺癌的轉移能力是目前提高患者生存時間及生活質量的重要手段。G蛋白信號調節(jié)蛋白2（G-protein signaling modulator 2，GPSM2）最初被發(fā)現(xiàn)為調控細胞紡錘體的正確定位[3]，維持細胞的對稱性分裂[4-6]，在參與細胞分裂的G2/M期發(fā)揮了重要的功能[7]。Fukukawa等[8]報道了GPSM2與乳腺癌發(fā)病密切相關。胰腺癌組織中GPSM2的過表達已被證實，且其表達水平與腫瘤分化程度、腫瘤臨床分期及胰腺癌患者的預后息息相關[9-10]。筆者前期實驗中發(fā)現(xiàn)，人胰腺癌MIA-PaCa-2細胞的GPSM2表達水平高于其他胰腺癌細胞株（PANC-1、AsPC-1），且該細胞株具有高侵襲轉移能力[11-12]。本研究將通過構建GPSM2穩(wěn)定高表達的胰腺癌細胞株，并在人胰腺癌MIA-PaCa-2細胞上鑒定其表達效率，觀察過表達GPSM2的MIA-PaCa-2細胞遷移能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MIA-PaCa-2細胞（中國科學院細胞庫），真核表達載體pCMV-Tag 3B、嘌呤霉素質粒（中國碧云天公司），限制性核酸內切酶EcoR V和Xho I及T4DNA連接酶（NEB公司），Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，聚凝胺（吉滿生物有限公司），DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司），小量抽提試劑盒（杭州愛思進生物技術有限公司），Opti-MEM（北京索寶來科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司），realtime PCR試劑盒、TRIzol、RNA溶解液（南京百斯凱科技有限公司），小鼠抗人GPSM2抗體、小鼠抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗小鼠IgG抗體（江蘇厚普生物技術科技有限公司），β-actin抗體（Sigma公司），DMEM基高糖礎培養(yǎng)基（Hyclone公司)，所有的引物合成均來源上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GPSM2過表達真核載體的構建及鑒定 按照TRIzol法提取新鮮胰腺癌細胞的總RNA，采用反轉錄試劑盒擴增cDNA。PCR擴增GPSM2序列，并純化回收。根據(jù)GenBank中GPSM2 cDNA序列設計并合成引物，設計的GPSM2引物上游序列:5'-TGA TAT CAT GGA GGA AAA TTT GA-3'，下游序列:5'-CTC GAG CTA ATG GTC TGC CGAT-3'。在上游引物的5'端加入EcoR V限制性核酸內切酶位點，在下游引物5'端加入Xho I限制性核酸內切酶位點，下劃線部分為酶切識別位點。EcoR V和Xho I分別雙酶切GPSM2片段和pCMV-Tag 3B質粒后，T4DNA連接酶進行連接反應。將重組表達載體轉染用氯化鈣法制備的新鮮大腸桿菌感受態(tài)細胞，并挑選出陽性克隆進行PCR擴增，送公司測序驗證。測序正確后將構建的重組表達質粒命名為pCMV-Tag 3B-GPSM2。

1.2.2 重組質粒轉染胰腺癌MIA-PaCa-2細胞及獲得穩(wěn)定表達細胞株 MIA-PaCa-2胰腺癌細胞轉染前24 h接種于10 cm培養(yǎng)皿中，轉染前2 h再換用8 mL高糖DMEM新鮮培養(yǎng)基（不含抗生素，含10%FBS），轉染時細胞融合度為60%～70%。pCMV-Tag 3B-GPSM2、空載pCMV-Tag 3B分別與嘌呤霉素質粒共轉染，37 ℃、5%CO2孵育轉染細胞4 h后，換完全培養(yǎng)基。每2天換用含3 μg/mL嘌呤霉素新鮮完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)轉染MIAPaCa-2細胞株45 d。

1.2.3 運用RT-PCR檢測GPSM2 mRNA的表達水平 采用TRIzol法分別提取pCMV-Tag 3B-GPSM2轉染MIA-PaCa-2細胞（基因重組組）、pCMV-Tag 3B轉染的MIA-PaCa-2細胞（陰性對照組）及未轉染MIA-PaCa-2細胞（空白對照組）的總RNA，逆轉錄，變性獲得單鏈cDNA模板。反應體系共25 μL，反應程序:95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，40 個循環(huán)；然后 72 ℃延伸10 min。PCR引物序列為:GPSM2上游5'-GGC CAT TGA TTA TCA TCT GAA GC-3'，下游5'-TCC TTA CCG TGT TTG AAA GGA A-3'，擴增產物為99 bp；內參GAPDH上游5'-CCA CTA GGC GCT CAC TGT TC-3'， 下 游5'-AGG CGC CCA ATA CGA CCA A-3'，擴增產物為108 bp。

1.2.4 Western blot檢測胰腺癌細胞中GPSM2、β-catenin蛋白表達水平 將胰腺癌細胞加入裂解液，置冰上進行超聲裂解35～40 min，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，采用碧云天BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白質濃度，并進行蛋白質定量。取100 μg細胞總蛋白與上樣緩沖液混合后，經(jīng)100 ℃ 5 min變性后至SDS-PAGE電泳，蛋白被轉膜儀轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉+TBST封閉2 h，加入一抗過夜（4 ℃），充分洗滌，隨后加入1:2 000稀釋的二抗，室溫下培育1 h；洗滌、DAB顯色、暗室中膠片曝光、顯影、定影后觀察。

1.2.5 Transwell實驗檢測胰腺癌細胞的遷移能力將上述3組胰腺癌細胞分別采用常規(guī)消化傳代方法，制成細胞懸液，計數(shù)，調整濃度為2×105/mL。在Chamber下室（即24孔板底部）中加入700 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h；取出Chamber，吸干上室液體，移到預先加入800 mL 4%多聚甲醛的孔中，室溫固定20 min；取出Chamber，PBS清洗兩次。再將Chamber移至100%甲醇室溫固定20 min。將Chamber移到預先加入Giemsa染液的孔中，室溫染色15 min；PBS清洗Chamber，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；徹底晾干Chamber后，熒光倒置顯微鏡計數(shù)、拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異采用配對t檢驗，GPSM2與β-catenin蛋白之間的相關性采用一元線性回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 重組載體的鑒定

挑取pCMV-Tag 3B-GPSM2載體轉染的陽性菌落，接種到含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，用小量抽提試劑盒進行質粒抽提。所得質粒用雙酶切鑒定。酶切結果表明，被切開的是陽性克隆。并將陽性克隆進行PCR擴增，送上海英駿測序顯示重組質粒的GPSM2編碼序列與設計的片段完全一致，表明pCMV-Tag 3B-GPSM2重組載體構建成功（圖1）。

圖1 測序法鑒定構建的重組質粒（箭頭所標識的為GPSM2插入位置ATG）Figure 1 Sequencing identi fication of the recombinant plasmids (arrow showing GPSM2 insertion position of ATG codons

2.2 重組穩(wěn)定細胞株的建立

pCMV-Tag 3B-GPSM2、空載pCMV-Tag 3B分別與嘌呤霉素質粒共轉染的MIA-PaCa-2細胞，在含3 μg/mL嘌呤霉素新鮮完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)45 d后，存活的細胞株為重組穩(wěn)定細胞株。

2.3 RT-PCR驗證GPSM2 mRNA的高水平表達

RT-PCR檢測結果顯示，GPSM2轉染組的GPSM2 mRNA表達水平較空白對照組和陰性對照組均明顯上調（圖2）（P＜0.01），與空白對照組相比，GPSM2基因上調效率達到了73.3倍。陰性對照組與空白對照組間GPSM2 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組胰腺癌細胞GPSM2 mRNA的表達情況Figure 2 The GPSM2 mRNA expressions in each group of pancreatic cancer cells

2.4 Western blot檢測各組細胞GPSM2、β-catenin蛋白表達水平

Western blot檢測結果顯示，GPSM2轉染組的GPSM2、β-catenin蛋白表達水平均較空白對照組和陰性對照組明顯升高（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組間兩種蛋白的表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖3）。經(jīng)一元線性回歸發(fā)現(xiàn)，各組胰腺癌細胞的GPSM2與β-catenin蛋白的表達量呈明顯的正向線性關系（P＜0.05）。

圖3 Western blot檢測各組細胞GPSM2與β-catenin蛋白表達Figure 3 Western blot analyses for GPSM2 and β-catenin protein expressions in each group of cells

2.5 Transwell遷移細胞計數(shù)

Transwell實驗結果顯示，GPSM2轉染組的遷移細胞計數(shù)比空白對照組和陰性對照組明顯增多（均P＜0.01），而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 Transwell實驗檢測各組細胞遷移能力 A:光鏡下情況（×100）；B:各組遷移細胞計數(shù)Figure 4 Migration ability in each group of cells by determined Transwell assay A:Views under microscope (×100); B:Numbers of migrated cells in each group

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體屬于膜蛋白受體，這類受體的立體結構中都有7個跨膜α螺旋，且其肽鏈的C端和連接第5和第6個跨膜螺旋的胞內環(huán)上都有G蛋白的結合位點[13]。據(jù)統(tǒng)計，與G蛋白偶聯(lián)受體密切相關的疾病為數(shù)眾多，大約有40%的現(xiàn)代藥物是以G蛋白偶聯(lián)受體作為靶點[14-15]。近年新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體（蛋白酶激活受體）與消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關[16]。GPSM2屬于G蛋白信號調節(jié)蛋白家族，在人體各組織細胞中廣泛表達，人染色體上的定位區(qū)域為1q31-1q32。McCudden等[17]發(fā)現(xiàn)GPSM2蛋白為G蛋白信號傳導的負調節(jié)子。有報道[8,18]稱，GPSM2的表達與多種惡性腫瘤的發(fā)病、增殖相關，如乳腺癌，前列腺癌，尤文肉瘤等。在胰腺癌細胞中GPSM2過表達，其表達水平與腫瘤的分化程度、臨床分期相關，且腫瘤分化程度越低GPSM2的表達水平越高[10]。

β-catenin是由一條多肽鏈組成的胞質糖蛋白，其相對分子量92～95 kD，在人染色體的定位區(qū)域3p21.3-P22，全長為23.2 kb[19]。β-catenin蛋白是Wnt信號通路中的關鍵分子，當Wnt信號異常激活時，β-catenin在胞質積聚、細胞核移位，并激活下游的靶基因，從而誘發(fā)多種惡性腫瘤，如胰腺癌、肝癌、乳腺癌、白血病、黑色素瘤等[20]。據(jù)報道[21-22]，在肝癌、結直腸癌等多種消化道惡性腫瘤細胞中普遍存在著β-catenin基因第三外顯子突變，β-catenin蛋白在這些腫瘤細胞內異常聚積。腫瘤細胞的侵襲轉移能力與其黏附性、細胞增殖能力、細胞外基質的降解以及腫瘤血管的形成等存在著明顯的相關性。β-catenin作為黏附蛋白，與E-cadherin結合形成復合物后，定位于細胞膜，由此維持著細胞間的黏附性。β-catenin的異常高表達可明顯降低腫瘤細胞間的黏附能力，從而導致腫瘤細胞從其原發(fā)灶中脫落并發(fā)生轉移[23]。另有報道[24]稱，β-catenin的異常高表達可使細胞膜完整性受損，并會引起血管內皮生長因子的生成增加，從而促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉移。

為了探究GPSM2對胰腺癌遷移能力的影響，本研究通過構建GPSM2過表達真核載體，并將其轉染人胰腺癌細胞MIA-PaCa-2，RT-PCR和Western-blot分別驗證了在mRNA和蛋白水平有效上調GPSM2基因。采用Transwell遷移實驗顯示，過表達GPSM2的MIA-PaCa-2穩(wěn)定細胞株較空白對照組及陰性對照組的遷移能力明顯上升。根據(jù)研究結果得出，GPSM2基因的上調能顯著提升胰腺癌MIA-PaCa-2細胞的遷移的能力。Western blot檢測顯示過表達GPSM2的MIA-PaCa-2穩(wěn)定細胞株的β-catenin蛋白表達水平較空白對照及陰性對照組顯著上調。用一元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，各組胰腺癌組織的GPSM2與β-catenin蛋白的表達量呈正向線性關系。

β-catenin的異常表達在胰腺癌侵襲轉移的作用已經(jīng)得到廣泛認同[25-27]，本研究結果發(fā)現(xiàn)，GPSM2與β-catenin蛋白在胰腺癌細胞中表達的關聯(lián)性，同時還發(fā)現(xiàn)在胰腺癌MIA-PaCa-2細胞中過表達GPSM2后，胰腺癌細胞的遷移能力明顯增強。由此推測，胰腺癌細胞中GPSM2的過表達能增強β-catenin蛋白的表達，可能由此促進胰腺癌細胞的遷移能力。

因此針對GPSM2設計治療方案，降低胰腺癌細胞的遷移能力，提高胰腺癌患者生存時間及生活質量，可能成為抗胰腺癌藥物研究中新的分子靶點。后續(xù)的研究中，本課題組將增加沉默GPSM2表達的胰腺癌細胞株，進一步驗證GPSM2的過表達可促進胰腺癌細胞的遷移能力。

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