鄭春雷，鮑紅光，高紅

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 腫瘤外科， 黑龍江 齊齊哈爾 16100；2.黑龍江省齊齊哈爾市第二醫(yī)院 外科， 黑龍江齊齊哈爾 161006）

泛素-蛋白酶系統(tǒng)能夠降解蛋白質(zhì)，具有重要的生物學(xué)功能，泛素-蛋白酶系統(tǒng)參與細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡，參與炎癥反應(yīng)，具有遞呈抗原、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生命活動(dòng)，泛素連接酶E3在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，Cullin家族高度保守，屬于E3連接酶，CUL4A是其家族成員之一，CUL4A的結(jié)構(gòu)和功能與泛素連接酶Cullin 4B（Ubiquitin ligase Cullin 4B，CUL4B）比較相似，通過(guò)和DNA損傷蛋白、ROC1環(huán)指蛋白結(jié)合形成泛素連接酶復(fù)合物，發(fā)揮降解底物蛋白的作用[1-2]。CUL4A在乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、惡性胸膜間質(zhì)瘤等多種腫瘤中呈高表達(dá)[3-5]，也有研究[6]發(fā)現(xiàn)CUL4A在肝癌中也呈高表達(dá)，但CUL4A在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用尚不十分明確，本研究對(duì)肝癌組織中CUL4A的表達(dá)情況進(jìn)行研究，并研究CUL4A對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討CUL4A在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1　研究對(duì)象

選擇2013年1月—2015年12月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理中心72例肝癌術(shù)后肝癌組織標(biāo)本及其癌旁組織（距離肝癌組織5 cm以上）標(biāo)本和72例肝血管瘤術(shù)后正常肝組織標(biāo)本做為研究對(duì)象，所有肝癌患者術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放化療等治療，首次進(jìn)行手術(shù)治療。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，均經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2　細(xì)胞及主要試劑

實(shí)驗(yàn)前對(duì)正常肝細(xì)胞和Hep-G2、QSG-7701肝癌細(xì)胞株中CUL4A的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，CUL4A在正常肝細(xì)胞中表達(dá)水平低，在Hep-G2、QSG-7701肝癌細(xì)胞株中呈較高表達(dá)，因此選擇Hep-G2和QSG-7701肝癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，細(xì)胞株均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所。試劑： CUL4A siRNA（美國(guó)sigma公司），胰蛋白酶、胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司），抗CUL4A抗體、抗β-actin抗體（CST公司）等。

1.3　方法

1.3.1臨床資料收集收集72例肝癌患者的年齡、性別及臨床病理等資料。

1.3.2檢測(cè)CUL4A的表達(dá)采用免疫組化法檢測(cè)肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中CUL4A的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果評(píng)分：根據(jù)免疫組化染色范圍和強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：染色范圍：染色范圍為0%為0分，染色范圍為1%～25%為1分，染色范圍為26%～50%為2分，染色范圍為51%～75%為3分，染色范圍為76%～100%為4分；染色強(qiáng)度：染色陰性為0分，染色弱陽(yáng)性為1分，染色陽(yáng)性為2分，染色強(qiáng)陽(yáng)性為3～4分。免疫組化評(píng)分為染色范圍和染色強(qiáng)度相乘。

1.3.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Hep-G2和QSG-7701肝癌細(xì)胞接種到96孔板中，用CUL4A-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，并以NC-siRNA做為對(duì)照，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后吸出培養(yǎng)基，加入CCK混合液孵育，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的OD值，每天同一時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)監(jiān)測(cè)7 d。

1.3.4細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Hep-G2和QSG-7701肝癌細(xì)胞接種到12孔板中培養(yǎng)，待肝癌細(xì)胞達(dá)85%以上融合時(shí)，用CUL4A-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，并以NC-siRNA做為對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，進(jìn)行PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞周期。

1.3.5侵襲實(shí)驗(yàn)在24孔板中加入RPMI1640培養(yǎng)液，孔上置入處理過(guò)的鋪有Matrigel基質(zhì)膠的小室，將CUL4A-siRNA 和NC-siRNA轉(zhuǎn)染的Hep-G2和QSG-7701肝癌細(xì)胞懸液加入小室的上室中培養(yǎng)48 h，取出小室加入甲醇固定，加入結(jié)晶紫染液染色，高倍顯微鏡下拍照并觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.6遷移實(shí)驗(yàn)小室中不鋪Matrigel基質(zhì)膠，細(xì)胞接種培養(yǎng)后12 h進(jìn)行染色，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，相關(guān)性研究采用Spearman相關(guān)分析，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　CUL4A在肝癌組織中的表達(dá)

肝癌組織中CUL4 A的免疫組化評(píng)分（7.64±2.47）分明顯高于癌旁組織（1.23±0.36）分和正常肝組織（0.87±0.12）分（P=0.000）；癌旁組織和正常肝組織中CUL4A的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1　CUL4A的不同肝組織中的表達(dá)情況（×200）　A：肝癌組織；B ：癌旁組織；C ：正常肝組織

2.2　CUL4A與肝癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

肝癌組織中CUL4 A的表達(dá)與肝癌的分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T N M分級(jí)有關(guān)（P＜0.05），與患者的年齡和性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）；低分化程度肝癌組織中CUL4A的表達(dá)明顯高于中/高分化肝癌組織（P＜0.05），肝癌直徑＞5 cm肝癌組織中CUL4A的表達(dá)高于直徑≤5 cm肝癌組織（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌組織中CUL4A的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），TNM分級(jí)III級(jí)肝癌組織中CUL4A的表達(dá)高于I～I(xiàn)I級(jí)（P＜0.05）（表1）。

表1　CUL4A的表達(dá)與肝癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

2.3　CUL4A對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響

轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的Hep-G2肝癌細(xì)胞株在3 d和7 d時(shí)的OD值明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05）（表2）；轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的QSG-7701肝癌細(xì)胞株在3 d和7 d時(shí)的OD值明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05）（表3）。

2.4　CUL4A對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的Hep-G2肝癌細(xì)胞株S期細(xì)胞比例低于NC-siRNA組（P＜0.05）（表4）；轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的QSG-7701肝癌細(xì)胞株S期細(xì)胞比例低于NC-siRNA組（P＜0.05）（表5）。

表2　CUL4A對(duì)Hep-G2肝癌細(xì)胞株增殖的影響

表3　CUL4A對(duì)QSG-7701肝癌細(xì)胞株增殖的影響

表4　CUL4A對(duì)Hep-G2肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)周期的影響

表5　CUL4A對(duì)QSG-7701肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)周期的影響

2.5　CUL4A對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的Hep-G2肝癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力低于NC-siRNA組（P＜0.05）（圖2）；轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的QSG-7701肝癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力低于NC-siRNA組（P＜0.05）（圖3）。

圖2　CUL4A對(duì)Hep-G2肝癌細(xì)胞株侵襲遷移的影響　A：CUL4A-siRNA侵襲；B：NC-siRNA侵襲；C：CUL4A-siRNA遷移；D：NC-siRNA遷移

圖3　CUL4A對(duì)QSG-7701肝癌細(xì)胞株侵襲遷移的影響　A：CUL4A-siRNA侵襲；B：NC-siRNA侵襲；C：CUL4A-siRNA遷移；D：NC-siRNA遷移

3　討　論

CUL4A屬于通過(guò)泛素化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解，Cullin家族成員[7]，是最大類的E3泛素連接酶，CUL4A能夠調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的分化，能夠調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的分化和增殖，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8-9]。在乳腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)[10-12]，被推斷為是癌基因，CUL4A可以激活E2F1的活性，對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)；CUL4A還可以修飾p27、p21、p53等蛋白使細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖，CUL4A 能夠通過(guò)MDM2對(duì)P53進(jìn)行調(diào)節(jié)，CUL4A表達(dá)的升高能夠降解P53，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生[13-20]。

王允山等[5]發(fā)現(xiàn)CUL4A在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用；李振宇[10]發(fā)現(xiàn)CUL4A在結(jié)腸癌中異常表達(dá)，并和結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展關(guān)系密切；韓小妮等[13]發(fā)現(xiàn)CUL4A在卵巢癌中異常表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究[6]發(fā)現(xiàn)CUL4A在正常肝組織中低表達(dá)，在肝癌組織中為高表達(dá)，但CUL4A在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制尚不清楚，CUL4A是否也影響肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)？是否影響肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移？本研究對(duì)肝癌組織中CUL4A的表達(dá)情況進(jìn)行研究，并探討CUL4A對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肝癌組織中CUL4A的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肝組織。肝癌組織中CUL4A的表達(dá)和肝癌的分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分級(jí)有關(guān)。轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌細(xì)胞株在3 d和7 d時(shí)的OD值明顯高于NC-siRNA組。轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌細(xì)胞株S期細(xì)胞比例低于NC-siRNA組。轉(zhuǎn)染CUL4A-siRNA的Hep-G2、QSG-7701肝癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力低于NC-siRNA組。本研究結(jié)果證實(shí)了CUL4A在肝癌組織中呈高表達(dá)，CUL4A的高表達(dá)和肝癌的臨床病理特點(diǎn)關(guān)系密切，Hep-G2和QSG-7701肝癌細(xì)胞株中CUL4A下調(diào)后細(xì)胞的增殖受到抑制、S期細(xì)胞比例降低、侵襲轉(zhuǎn)移能力下降，表明CUL4A可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、影響肝癌細(xì)胞周期，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。CUL4A在肝癌中發(fā)揮促癌基因的作用，CUL4A促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，影響肝癌細(xì)胞周期以及促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，可能與CUL4A修復(fù)損傷的DNA，修飾p27、p21、p53等蛋白阻止細(xì)胞周期從而抑制細(xì)胞增殖，CUL4A 和P53關(guān)系密切，CUL4A高表達(dá)可以降解P53，從而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性[21-25]。

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