李源，貝媛媛，于丹，徐永波，李坤，褚海波

（1. 濰坊醫(yī)學院 研究生部，山東 濰坊 261053；2. 中國人民解放軍第八十九醫(yī)院 普外中心，山東 濰坊 261021）

下肢靜脈曲張是血管外科的常見疾病，發(fā)病率為30%，其發(fā)病機制仍不清楚[1-2]。靜脈曲張的風險因素與女性、站立職業(yè)、肥胖、妊娠、老年、深靜脈血栓及家庭遺傳相關(guān)[3]。研究[4]表明，靜脈高壓和缺氧可導致靜脈膨脹、重塑及結(jié)構(gòu)改變，同時還可觸發(fā)大分子和紅細胞外溢，微血管內(nèi)皮激活，白細胞滲出，細胞外基質(zhì)（ECM）改變，膠原沉積。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）分為收縮型和合成型，兩種表型分別具有收縮和產(chǎn)生細胞外基質(zhì)功能。合成型VSMCs可以過度增殖和遷移進而導致血管病理性改變，形成靜脈曲張[5]。因此，研究VSMCs表型與功能的變化，可從細胞和分子水平闡明靜脈曲張的發(fā)病機制。本文通過建立曲張靜脈和正常靜脈VSMCs的培養(yǎng)方法，采用多種手段檢測兩種靜脈VSMCs的表型和功能，并比較兩者之間的差異性。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取2015年1月—2016年6月中國人民解放軍第八十九醫(yī)院收治的大隱靜脈曲張患者13例（曲張組），其中男8例，女5例；年齡51～60（平均56）歲。同期獲取冠狀動脈搭橋手術(shù)患者的大隱靜脈15例（正常組），其中男8例，女7例；年齡52～60（平均56）歲。所有病例獲中國人民解放軍第八十九醫(yī)院人類研究倫理委員會批準（編號：1538）和患者的知情同意。排除標準：下肢嚴重水腫、靜脈曲張伴皮膚改變、急性或亞急性血栓性靜脈炎（血栓形成時間＜14 d或＜30 d）、慢性血栓性靜脈炎、非血栓性靜脈炎、動脈疾病及糖尿病患者。

1.2 主要試劑和設備

DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone，美國）；胎牛血清（HyClone，美國）；胰蛋白酶（HyClone，美國）；特異性α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（北京中杉金橋生物有限公司，中國）；Cell Counting Kit試劑盒（碧云天生物科技有限公司，中國）；纖維連接蛋白（Roche，德國）；β-半乳糖苷酶試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，中國）；FITC-Phalloidin（Enzo Life Sciences，瑞士）；TRIzol（北京康為世紀生物技術(shù)有限公司，中國）；SYBR PrimeScript RTPCR Kit II及相關(guān)引物設計合成（大連寶生物工程有限公司，中國）；MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2抗體（Abcam，英國）；小鼠抗β-actin抗體（北京中杉金橋生物有限公司，中國）；Bax、Bcl-2、caspase-3抗體（Cell Signaling Technology，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；Boyden小室（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠，中國）；酶標儀（Bio-Rad Laboratories, 美國）；熒光顯微鏡（Leica，德國）；熒光定量PCR儀（Bio-RadIQ5，美國）。

1.3 方法

1.3.1 VSMCs分離培養(yǎng) 術(shù)中獲取膝下無菌大隱靜脈標本3 cm，眼科鑷撕去外膜及脂肪組織，眼科剪縱向剖開血管，牙科探針刮去內(nèi)膜，用PBS漂洗干凈。將血管中層剪成1.0 mm×1.0 mm大小組織塊，用吸管將組織塊按3～5塊/cm2的密度平鋪于25 mL玻璃培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3～4 mL。粘有植塊的瓶底朝上，在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中放置4～5 h后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液緩慢浸入植塊。每3 d更換1次培養(yǎng)液，12～14 d后，倒置顯微鏡下觀察，植塊周圍有細胞爬出，待3～4周后細胞融合成片，常規(guī)消化傳代。選擇傳代的第3～5代細胞進行后續(xù)實驗檢測。

1.3.2 VSMCs鑒定 原代培養(yǎng)的VSMCs 12～14 d，倒置顯微鏡下顯示：細胞沿組織塊邊緣爬出，呈放射狀向外生長形成細胞暈；細胞貼壁生長，多呈長梭形，突起相互接觸。部分呈多角形或不規(guī)則形，有長短不一的胞突；3～4周后，細胞匯合成片并平行排列，細胞呈“峰谷”狀生長。部分細胞呈旋渦狀生長或呈多重疊生長，在瓶底形成一層厚厚的膜；平滑肌α-SMA免疫熒光染色后可見胞漿內(nèi)染成紅色，即呈陽性染色（圖1）。

圖1 正常VSMCs表型 A：VSMCs形成細胞暈（×40）；B：VSMCs呈長梭形或多角形（×100）；C：VSMCs呈“峰谷”狀生長（×40）；D：α-SMA免疫熒光染色陽性（×400）Figure 1 Normal phenotype of the VSMCs A: Halo formation of the VSMCs (×40); B: VSMCs presenting a fusiform or polygonal shape(×100); C: Peak-valley-like growth of the VSMCs (×40); C: Positive immunofluorescent staining for α-SMA (×400)

1.3.3 細胞增殖檢測 采用CCK-8試劑檢測細胞增殖。取對數(shù)生長期的VSMCs用胰蛋白酶消化后按2×103細胞/mL密度接種至96孔板。每孔接種細胞懸液100 μL，每組設5個復孔。待細胞融合至80%，吸棄各孔培養(yǎng)基，CCK-8試劑和培養(yǎng)基以1:10比例混合后加入孔內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min，酶標儀測定各孔波長450 nm處吸光度。

1.3.4 細胞遷移檢測 采用改良Boyden小室法觀察細胞遷移。以2×104細胞/mL密度將100 μL細胞懸液注入Boyden小室上室，培養(yǎng)基加滿下室。置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8 h后，取出濾膜，刮除濾膜上面的未移動細胞，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下（×100）隨機選取5個視野拍照，計數(shù)每個視野內(nèi)的遷移細胞，取其平均數(shù)。

1.3.5 細胞黏附檢測 將VSMCs用胰蛋白酶消化，按1×104細胞/mL密度接種至預先用人纖維連接蛋白包被的24孔板中。每孔接種細胞懸液500 μL，置于37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后，PBS洗滌3次清除未貼壁細胞。顯微鏡下（×100）隨機選取5個視野拍照，計數(shù)每個視野內(nèi)的貼壁細胞, 取其平均數(shù)。

1.3.6 細胞衰老檢測 采用β-半乳糖苷酶法檢測細胞衰老。將VSMCs用胰蛋白酶消化后接種至24孔板，每孔接種細胞懸液500 μL。待細胞鋪滿板底后按照β-半乳糖苷酶檢測試劑盒說明書進行洗滌、固定、染色，37 ℃無CO2培養(yǎng)箱中避光反應18 h。衰老特異性β-半乳糖苷酶的細胞呈現(xiàn)藍綠色為陽性表達。顯微鏡下（×100）觀察并拍照，分別計數(shù)3個不同視野，計算陽性細胞數(shù)，取其平均數(shù)。

1.3.7 細胞骨架檢測 采用F-actin熒光標記染色法檢測細胞骨架。VSMCs用胰蛋白酶消化后接種于玻片上，細胞長至40%左右，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3遍。1% BSA室溫封閉30 min后加入FITC-Phalloidin（5 μg/mL），37 ℃閉光染色30 min，PBS清洗3遍，加入DAPI，37 ℃閉光染色15 min，PBS清洗3次，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下（×400）觀察并拍照。

1.3.8 熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)分子與ECM代謝相關(guān)因子mRNA表達 細胞總RNA按TRIzol試劑說明書提取，溶于DEPC 處理的去離子水中，-80℃保存?zhèn)溆?。熒光定量RT-PCR采用SYBR Green法。相關(guān)基因引物序列如表1所示，實驗中以管家基因GAPDH作為內(nèi)參，以超純水（PCR級，無RNase）作為陰性對照。結(jié)果分析按2-ΔΔCt來計算出各組擴增效率。

表1 相關(guān)基因的引物序列及擴增產(chǎn)物大小Table 1 Sequences of the primers and lengths of their products

1.3.9 Western blot檢測凋亡相關(guān)分子與ECM代謝相關(guān)因子蛋白表達 細胞總蛋白按蛋白提取試劑說明書提取，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清，加入蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃沸水煮5 min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ茲饪s膠、分離膠，灌膠后加入蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳約3.5 h，轉(zhuǎn)膜用濕轉(zhuǎn)法，200 mA恒流30～120 min。脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃冰箱孵育過夜。TBST震蕩洗滌5×10 min/count，二抗室溫孵育1 h。TBST震蕩洗滌5×10 min/count，滴加ECL發(fā)光液于暗室內(nèi)曝光顯色，蛋白條帶采用Image-J圖像分析軟件進行掃描和分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 VSMCs增殖能力檢測

CCK-8檢測結(jié)果顯示，曲張組VSMCs細胞增殖數(shù)量與正常組VSMCs相比明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖 2 兩組VSMCs增殖能力比較Figure 2 Comparison of the proliferative abilities between the twogroups of VSMCs

2.2 VSMCs黏附能力檢測

曲張組VSMCs和正常組VSMCs細胞黏附密度不同。與正常組VSMCs比較，曲張組VSMCs細胞黏附數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖 3 兩組VSMCs黏附細胞分布（×100）與數(shù)量比較Figure 3 Comparison of the distribution (×100) and number of the adherent cells between the two groups of VSMCs

2.3 VSMCs遷移能力檢測

兩組VSMCs遷移細胞密度不同。與正常組VSMCs比較，曲張組VSMCs遷移細胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 兩組VSMCs遷移細胞分布（×100）與數(shù)量Figure 4 Comparison of the distribution (×100) and number of the migrating cells between the two groups of VSMCs

2.4 VSMCs衰老能力檢測

兩組VSMCs衰老細胞密度不同。與正常組VSMCs比較，曲張組VSMCs衰老細胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 兩組VSMCs衰老細胞分布（×100）與數(shù)量比較Figure 5 Comparison of the distribution (×100) and number of the aging cells between the two groups of VSMCs

2.5 VSMCs骨架染色

曲張組VSMCs內(nèi)F-actin增多，胞漿中可見應力纖維絲，綠色熒光強度增強；正常組VSMCs的F-actin分布較為分散，細胞內(nèi)隱約可見絲狀結(jié)構(gòu)，胞漿中未見密集的應力纖維，綠色熒光強度低（圖6）。

圖6 兩組VSMCs細胞骨架染色（×400）Figure 6 Cytoskeleton staining of the two groups of VSMCs (×400)

2.6 細胞凋亡相關(guān)檢測

2.6.1 Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達與正常組VSMCs比較，曲張組VSMCs的Bax與caspase-3 mRNA表達明顯減少，而Bcl-2 mRNA表達則明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖 7）。

圖7 兩組VSMCs凋亡相關(guān)因子mRNA表達Figure 7 The mRNA expressions of the apoptosis associated factors in the two groups of VSMCs

2.6.2 Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白含量 與正常組VSMCs比較，曲張組VSMCs的Bax與caspase-3蛋白表達明顯減少，而Bcl-2蛋白表達則明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖8）。

2.7 基質(zhì)金屬蛋白酶及抑制物表達

2.7.1 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達 與正常組VSMCs比較，曲張組VSMCs中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖9）。

2.7.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋 白含量 與正常組VSMCs比較，曲張組VSMCs中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白含量均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖10）。

圖8 兩組VSMCs凋亡相關(guān)因子蛋白的表達Figure 8 The protein expressions of the apoptosis associated factors in the two groups of VSMCs

圖9 兩組VSMCs基質(zhì)金屬蛋白酶及抑制物mRNA表達Figure 9 The mRNA expressions of the extracellular matrix metabolism associated factors in the two groups of VSMCs

圖10 兩組基質(zhì)金屬蛋白酶及抑制物蛋白的表達Figure 10 The protein expressions of the extracellular matrix metabolism associated factors in the two groups of VSMCs

3 討 論

靜脈曲張時，VSMCs呈束狀排列，因膠原纖維含量增多，部分VSMCs束出現(xiàn)斷裂，肥大段管壁VSMCs的增殖和遷移增加[6]。透視電鏡顯示，VSMCs體積增大，伸長形態(tài)消失，即收縮型變?yōu)榉置谛蚚7]。肌動蛋白的微絲是VSMCs中最主要的細胞骨架。細胞骨架與細胞表型及細胞增殖之間存在內(nèi)在聯(lián)系，并影響細胞重塑。細胞分化型轉(zhuǎn)化為去分化型并獲得增殖能力，稱細胞表型轉(zhuǎn)化[8]。細胞表型轉(zhuǎn)化是細胞重塑的基礎。鈣調(diào)蛋白（calponin）可與肌動蛋白纖維結(jié)合后改變肌動蛋白纖維的結(jié)構(gòu)。平滑肌22α蛋白（smooth muscle 22 alpha）可與肌動蛋白纖維束和應力纖維共定位，并參與肌動蛋白纖維聚合和解聚過程[9]。本研究顯示，曲張靜脈VSMCs的增殖、黏附、遷移、衰老能力明顯增加，F(xiàn)-actin染色顯示微絲結(jié)構(gòu)增多。這一VSMCs表型與功能變化的結(jié)果與Xiao等[10]報道結(jié)果一致。結(jié)果表明，細胞表型轉(zhuǎn)化可提高VSMCs的增殖能力，肌動蛋白細胞骨架成分F-actin的變化則反映細胞的遷移能力。文獻[11-12]報道，缺氧和靜脈高壓可誘發(fā)VSMCs表型轉(zhuǎn)化和功能異常。此外，IncRNA-GA5和Desmuslin基因表達失調(diào)也會影響VSMCs的表型[13-14]。因此，研究VSMCs表型轉(zhuǎn)化和功能異常，可揭示靜脈曲張發(fā)生與發(fā)展的分子和基因靶標。

曲張靜脈VSMCs凋亡與靜脈疾病的不同階段VSMCs肥大和萎縮有關(guān)，因此，存在VSMCs凋亡上調(diào)或下調(diào)的分歧[15-16]。VSMCs凋亡增加可能與高流體靜力壓和年齡因素有關(guān)，這些因素可改變VSMCs的表型，加速VSMCs的更新代謝[16-17]。此外，TIMP-2的一種特殊表型也可促進VSMCs 凋亡[18]。SMCs凋亡抑制可能與缺氧和管壁膨脹、增厚及VSMCs表型變異因素有關(guān)。缺氧可促進抑凋亡蛋白Bcl-2的表達和VSMCs的轉(zhuǎn)型及功能失調(diào)，抑制細胞的程序死亡[7,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，曲張靜脈VSMCs促凋亡因子Bax和caspase-3 mRNA表達和蛋白含量明顯減少，而抑凋亡因子Bcl-2 mRNA表達和蛋白含量則明顯增加，提示VSMCs凋亡經(jīng)線粒體通路處于抑制水平。本研究結(jié)果與筆者前期的研究和相關(guān)文獻[20-23]一致。筆者認為，曲張靜脈VSMCs凋亡的抑制有利于VSMCs的增殖和遷移，符合筆者前期研究[24]的組織學和細胞學改變（平滑肌束增多、紊亂，向內(nèi)膜遷移致內(nèi)膜增厚；VSMCs細胞器成分增多，轉(zhuǎn)為分泌型）。細胞凋亡可維持細胞的數(shù)量和組織動態(tài)平衡。本研究在分子和基因水平證實曲張靜脈VSMCs凋亡下調(diào)，可能與細胞的更新代謝減少有關(guān)。本研究與文獻報道細胞凋亡增加不一致，分析可能與獲取標本的部位和靜脈膨脹程度存在差異性有關(guān)。

分化或成熟的VSMCs含有獨特的收縮蛋白，通過鈣離子通道傳遞分子信號功能。曲張靜脈管壁增厚時，VSMCs合成ECM失調(diào)。ECM為一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的蛋白，具有維持血管壁功能的作用。研究[25]表明，曲張靜脈管壁重塑與VSMCs受損和ECM過剩有關(guān)。ECM主要成分是膠原纖維。靜脈曲張時，III型膠原蛋白減少，I型膠原蛋白增多，這樣可導致VSMCs分泌大量MMPs和TIMPs，以降解沉積的ECM[26]。簡而言之，MMPs和TIMPs可調(diào)控和維持ECM的代謝水平[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，曲張靜脈VSMCs中MMPs和TIMPs mRNA表達和蛋白含量明顯增多，提示MMPs和TIMPs mRNA表達和蛋白含量處在上游和上調(diào)水平，但MMPs/TIMPs比值沒有失調(diào)，推測可能與TIMPs處于代償期有關(guān)。本研究結(jié)果與Lim等[28]和Pfisterer等[29]報道一致。MMPs和TIMPs蛋白增多可間接反映變性膠原蛋白的消化，以減少ECM的沉積，延緩靜脈曲張的發(fā)展[30-31]。研究[32]表明，轉(zhuǎn)化生長因子β是一種SMCs的分子信號調(diào)節(jié)器，能調(diào)節(jié)VSMCs對MMPs和TIMPs的合成。筆者認為，VSMCs分泌的MMPs和TIMPs表達異?？赡芘c不同靜脈段（肥大和萎縮）有關(guān)，這可能是MMPs和TIMPs表達存在差異性的問題所在。

總之，VSMCs表型轉(zhuǎn)化是血管重塑的細胞學基礎。VSMCs表型轉(zhuǎn)化除了與其基因表達譜改變有關(guān)外，還受細胞骨架結(jié)構(gòu)與功能的影響。本文通過建立人正常VSMCs和靜脈曲張VSMCs單層培養(yǎng)系統(tǒng)，從VSMCs增殖、遷移、黏附、衰老、骨架、MMPs和TIMPs分泌及細胞凋亡方面研究曲張大隱靜脈來源VSMCs的生物學變化特征，初步證實曲張大隱靜脈VSMCs從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化并獲得增生、遷移和分泌大量細胞外基質(zhì)的能力。

志謝：本課題得到濰坊醫(yī)學院中心實驗室成敏教授、李宏和崔曉東副教授的大力幫助，謹表感謝。

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