盧婉怡

[摘要] 目的 優(yōu)化纖維素酶提高青蒿素提取率的反應(yīng)條件。 方法 應(yīng)用響應(yīng)面實驗方法采用中心組合實驗設(shè)計研究酶反應(yīng)過程中時間、加酶量、溫度對提取率的影響，并對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果 纖維素酶輔助提取青蒿素的最優(yōu)工藝條件：酶反應(yīng)時間2.9 h，酶添加量0.20 g，反應(yīng)溫度42.6℃。 結(jié)論 響應(yīng)面試驗方法能夠有效提高纖維素酶輔助提取青蒿素的提取率。

[關(guān)鍵詞] 青蒿素；纖維素酶；提??；響應(yīng)面

[中圖分類號] R94 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）01（a）-0004-03

青蒿素（Artemisinin）是從菊科植物黃花蒿（Art-emisia annua L.）的干燥地上部分提取分離得到[1]，因其含有過氧基團的倍半萜內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，使其對瘧疾具有“高效、速效、低毒”的突出療效[2]，被世界衛(wèi)生組織（WHO）稱為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。盡管青蒿素的化學(xué)合成、生物合成及組織培養(yǎng)相繼成功，但由于其產(chǎn)率低、成本高而難以投入工業(yè)化生產(chǎn)。青蒿素藥物的生產(chǎn)主要依靠從天然青蒿中提取[3]。工業(yè)化青蒿素提取方法中應(yīng)用最廣的是常規(guī)有機溶劑提取法[4]，常用溶劑包括乙醇、溶劑汽油和石油醚等[5]。由于青蒿素在黃花蒿中含量低，常規(guī)有機溶劑提取法存在提取率低、耗時長、溶劑消耗大等問題[6]。近年來，一些用于天然產(chǎn)物提取的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，如微波、超聲波和酶技術(shù)等，取得了顯著成效。其中酶技術(shù)具有反應(yīng)效率高、條件溫和、提取時間短、專一性強、易于控制和有效成分破壞少等優(yōu)點[7]，是眾多研究的熱點?？捎糜谳o助提取的酶的種類很多，纖維素酶是最常用的酶類之一，它能夠水解纖維素-1，4-糖苷鍵，破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，從而提高提取率，因而在中草藥有效成分的分離提取方面取得了不少成果[8]。

我國是黃花蒿的主產(chǎn)國，資源豐富，植物提取青蒿素的產(chǎn)量占全球青蒿素產(chǎn)量的90%以上。將酶技術(shù)應(yīng)用于青蒿素的提取過程，對提高青蒿素的提取效率、充分利用資源有重要意義。本研究考察了纖維素酶輔助提取青蒿素的條件，利用響應(yīng)面試驗分析酶反應(yīng)過程各因素對提取率的影響，并優(yōu)化酶輔助提取工藝，為纖維素酶在青蒿素提取工藝上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

FW135型中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），752型紫外-可見分光光度計（上海菁華科學(xué)儀器有限公司）。

青蒿藥材購于廣州市清平中藥材市場，經(jīng)本校張小紅講師鑒定為菊科植物黃花蒿的干燥地上部分，藥材經(jīng)粉碎后過40目篩備用。纖維素酶Cellulase T4[來源于綠色木霉（Trichoderma viride）]購自天野酶制劑（上海）有限公司，比活力40 000 U/g（按濾紙崩解力，天野法計算）。青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品（百靈威科技有限公司，純度>98%）。無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、乙酸和乙酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶輔助提取青蒿素的方法 稱取1 g粉碎后的青蒿樣品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.5），先常溫下浸泡10 min，再加入一定量的纖維素酶，然后在一定溫度下水浴振蕩進(jìn)行酶反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后抽濾，將濾餅置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml無水乙醇，在45℃下水浴振蕩1 h，抽濾，取濾液測定青蒿素含量。

1.2.2 青蒿素含量的測定方法 青蒿素僅在紫外區(qū)203 nm處有較弱的末端吸收，但與堿反應(yīng)后，生成一化合物Q292，該物質(zhì)在292 nm處有最大吸收，可用紫外分光光度法檢測[9]。取樣品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組測定三個平行樣品，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出青蒿素含量。

1.2.3 響應(yīng)面實驗方法 響應(yīng)面實驗是通過對響應(yīng)面等值線的分析，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計方法。具有試驗次數(shù)少、精度高等優(yōu)點；同時還能夠?qū)Ω饕蜃拥慕换プ饔眠M(jìn)行評價，快速有效的確定最佳條件。其中包括多種設(shè)計方法，本研究利用Designexpert 7.0軟件進(jìn)行設(shè)計實驗與分析，響應(yīng)面實驗采用中心組合設(shè)計。中心組合設(shè)計試驗中每種因素取5種水平，以（-α、-1、0、1、α）編碼（本實驗中α=1.414）。本實驗選取酶反應(yīng)時間（A）、酶反應(yīng)溫度（B）和酶添加量（C）作為影響因素，中心組合實驗的編碼和水平見表1。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，溶于95%乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%乙醇溶液至5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組取三個平行樣品，取平均值。以青蒿素樣品濃度x（g/L）為橫坐標(biāo)，292 nm吸光值y為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果得線性方程為D292=1.065c+0.019（r2=0.9971）。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

利用Designexpert 7.0軟件設(shè)計的中心組合實驗數(shù)n=12，實驗設(shè)計表及結(jié)果如表2所示，實驗次序為隨機安排。

對中心組合實驗的結(jié)果在Designexpert 7.0軟件中進(jìn)行方差分析（ANOVA），結(jié)果表明，模型的P=0.0096，表明模型顯著。對因素的交互效應(yīng)分析表明，A、C、BC和A2為顯著影響因素，即酶反應(yīng)時間、加酶量、酶反應(yīng)溫度與加酶量交互作用和反應(yīng)時間的平方值為顯著影響因素。模型相關(guān)系數(shù)r2=0.9979，表明模型在99.79%程度上能夠解釋酶輔助提取率與變量之間的關(guān)系。模型的校正相關(guān)系數(shù)Adj r2=0.9882，與r2的數(shù)值相接近表明模型預(yù)測值和實際實驗結(jié)果具有良好的相關(guān)性。模型的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為2.58%，表明模型的可信任程度高。

由實驗結(jié)果分析導(dǎo)出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0軟件得出模型預(yù)測最大值為3.24，此時酶反應(yīng)時間為2.94 h，酶反應(yīng)溫度為42.62℃，酶添加量為0.199 g。對模型的預(yù)測值進(jìn)行驗證，取酶反應(yīng)時間2.9 h，酶反應(yīng)溫度42.6℃，酶添加量0.2 g，進(jìn)行三次平行試驗，得到青蒿素提取率的平均值為3.27 mg/g，驗證實驗的提取率與預(yù)測值基本吻合，表明優(yōu)化模型能夠很好地說明酶反應(yīng)各因素與提取率之間的關(guān)系。與未采用酶輔助提取時的提取率1.13 mg/g相比，優(yōu)化后酶輔助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶輔助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 討論

青蒿素主要存在與青蒿植物的莖葉組織中[2]，試驗結(jié)果顯示，纖維素酶Cellulase T4作用于青蒿能夠提高其中青蒿素的提取率，表明恰當(dāng)?shù)乩美w維素酶處理能夠克服植物組織中纖維素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影響纖維素酶水解植物細(xì)胞壁反應(yīng)的主要因素包括酶用量、酶反應(yīng)溫度和酶反應(yīng)時間等[10]，本研究利用響應(yīng)面實驗進(jìn)行分析，并對酶輔助提取青蒿素工藝中各顯著影響因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件下青蒿素的提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。本研究將纖維素酶應(yīng)用于青蒿素輔助提取方面，顯著提高了青蒿素的提取率，為酶技術(shù)在中藥制藥領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張鳳杰，劉祝祥，陳功錫.青蒿藥用成分提取方法及檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].吉首大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，31（4）：103-107.

[2] 夏錚錚.青蒿藥材及青蒿素系列藥物的含量測定方法研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2006.

[3] 李子穎，李士雨，齊向娟.青蒿素提取技術(shù)研究進(jìn)展[J].中藥研究與信息，2002，4（2）：17-21.

[4] 楊家慶，林燕芳，詹利之.青蒿中青蒿素提取工藝的優(yōu)化及含量測定[J].廣東藥學(xué)院院報，2012，28（1）：40-43.

[5] 陳秋實，陳孟蘭，范晶.青蒿素提取研究進(jìn)展[J].武漢生物工程學(xué)院院報，2007，3（2）：120-125.

[6] 錢國平.黃花蒿中提取與純化青蒿素的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2007.

[7] 張圣燕.纖維素酶在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用研究[J].廣東化工，2011，38（9）：59-60.

[8] 張巾英，張明春.應(yīng)用纖維素酶提取中草藥有效成分的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2007，41（1）：79-81.

[9] 李春莉，王莎莉，王亞平，等.紫外分光光度法測定青蒿素的含量[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，32（4）：413-415.

[10] 楊吉霞，蔡俊鵬，祝玲.纖維素酶在中藥成分提取中的應(yīng)用[J].中藥材，2005，28（1）：64-67.

（收稿日期：2013-09-10 本文編輯：林利利）

由實驗結(jié)果分析導(dǎo)出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0軟件得出模型預(yù)測最大值為3.24，此時酶反應(yīng)時間為2.94 h，酶反應(yīng)溫度為42.62℃，酶添加量為0.199 g。對模型的預(yù)測值進(jìn)行驗證，取酶反應(yīng)時間2.9 h，酶反應(yīng)溫度42.6℃，酶添加量0.2 g，進(jìn)行三次平行試驗，得到青蒿素提取率的平均值為3.27 mg/g，驗證實驗的提取率與預(yù)測值基本吻合，表明優(yōu)化模型能夠很好地說明酶反應(yīng)各因素與提取率之間的關(guān)系。與未采用酶輔助提取時的提取率1.13 mg/g相比，優(yōu)化后酶輔助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶輔助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 討論

青蒿素主要存在與青蒿植物的莖葉組織中[2]，試驗結(jié)果顯示，纖維素酶Cellulase T4作用于青蒿能夠提高其中青蒿素的提取率，表明恰當(dāng)?shù)乩美w維素酶處理能夠克服植物組織中纖維素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影響纖維素酶水解植物細(xì)胞壁反應(yīng)的主要因素包括酶用量、酶反應(yīng)溫度和酶反應(yīng)時間等[10]，本研究利用響應(yīng)面實驗進(jìn)行分析，并對酶輔助提取青蒿素工藝中各顯著影響因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件下青蒿素的提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。本研究將纖維素酶應(yīng)用于青蒿素輔助提取方面，顯著提高了青蒿素的提取率，為酶技術(shù)在中藥制藥領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了參考。

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[10] 楊吉霞，蔡俊鵬，祝玲.纖維素酶在中藥成分提取中的應(yīng)用[J].中藥材，2005，28（1）：64-67.

（收稿日期：2013-09-10 本文編輯：林利利）

由實驗結(jié)果分析導(dǎo)出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0軟件得出模型預(yù)測最大值為3.24，此時酶反應(yīng)時間為2.94 h，酶反應(yīng)溫度為42.62℃，酶添加量為0.199 g。對模型的預(yù)測值進(jìn)行驗證，取酶反應(yīng)時間2.9 h，酶反應(yīng)溫度42.6℃，酶添加量0.2 g，進(jìn)行三次平行試驗，得到青蒿素提取率的平均值為3.27 mg/g，驗證實驗的提取率與預(yù)測值基本吻合，表明優(yōu)化模型能夠很好地說明酶反應(yīng)各因素與提取率之間的關(guān)系。與未采用酶輔助提取時的提取率1.13 mg/g相比，優(yōu)化后酶輔助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶輔助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 討論

青蒿素主要存在與青蒿植物的莖葉組織中[2]，試驗結(jié)果顯示，纖維素酶Cellulase T4作用于青蒿能夠提高其中青蒿素的提取率，表明恰當(dāng)?shù)乩美w維素酶處理能夠克服植物組織中纖維素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影響纖維素酶水解植物細(xì)胞壁反應(yīng)的主要因素包括酶用量、酶反應(yīng)溫度和酶反應(yīng)時間等[10]，本研究利用響應(yīng)面實驗進(jìn)行分析，并對酶輔助提取青蒿素工藝中各顯著影響因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件下青蒿素的提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。本研究將纖維素酶應(yīng)用于青蒿素輔助提取方面，顯著提高了青蒿素的提取率，為酶技術(shù)在中藥制藥領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了參考。

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[4] 楊家慶，林燕芳，詹利之.青蒿中青蒿素提取工藝的優(yōu)化及含量測定[J].廣東藥學(xué)院院報，2012，28（1）：40-43.

[5] 陳秋實，陳孟蘭，范晶.青蒿素提取研究進(jìn)展[J].武漢生物工程學(xué)院院報，2007，3（2）：120-125.

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[7] 張圣燕.纖維素酶在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用研究[J].廣東化工，2011，38（9）：59-60.

[8] 張巾英，張明春.應(yīng)用纖維素酶提取中草藥有效成分的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2007，41（1）：79-81.

[9] 李春莉，王莎莉，王亞平，等.紫外分光光度法測定青蒿素的含量[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，32（4）：413-415.

[10] 楊吉霞，蔡俊鵬，祝玲.纖維素酶在中藥成分提取中的應(yīng)用[J].中藥材，2005，28（1）：64-67.

（收稿日期：2013-09-10 本文編輯：林利利）