張鴻超，逄詩玥，王海梅，韓巍巍2，姜瞻梅，杜鵬，侯俊財

（1.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030；2.哈爾濱豐瑞生物科技有限公司，哈爾濱150036）

不同初始pH值對保加利亞乳桿菌關(guān)鍵蛋白酶基因表達的影響

張鴻超1，逄詩玥1，王海梅1，韓巍巍2，姜瞻梅1，杜鵬1，侯俊財1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030；2.哈爾濱豐瑞生物科技有限公司，哈爾濱150036）

由于保加利亞乳桿菌自身不能直接利用外源蛋白，其必須通過蛋白水解體系外源蛋白質(zhì)，生成供菌體正常生長需要的短肽和游離氨基酸。選擇具有高蛋白水解活力的6株保加利亞乳桿菌作為供試菌種。將菌株接種于不同初始pH值的滅菌脫脂乳中，在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，探討保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中關(guān)鍵蛋白酶基因表達情況。結(jié)果表明：在脫脂乳體系中，初始pH值對保加利亞乳桿菌蛋白水解關(guān)鍵酶基因的表達存在顯著影響，隨著初始pH值的升高菌株KLDS 1.0501，1.9201，1.9203和1.0208的各基因表達量均上調(diào)，在pH=6.5時，部分基因表達量繼續(xù)上調(diào)，且各菌株間蛋白基因表達有較大差異。

保加利亞乳桿菌；蛋白水解體系；基因表達；實時熒光定量PCR

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指能夠在厭氧或兼性厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的菌。保加利亞乳桿菌是典型的乳酸菌，是酸乳發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸菌和產(chǎn)香菌[1]。乳酸菌的生長代謝需要利用小肽及游離氨基酸[2]，并依賴自身的蛋白水解體系[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌蛋白水解體系的結(jié)構(gòu)特征和乳球菌相似[5-7]。Picon等人[8]發(fā)現(xiàn)很多株菌中含有兩個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。Henriksen等人[9]通過對蛋白水解酶基因進行基因修飾得到水解能力更強的優(yōu)勢菌株。目前為止對保加利亞乳桿菌的蛋白水解酶體系相關(guān)酶基因表達量的研究較少[10]。本文旨在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，探討不同發(fā)酵初始pH值條件下保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中關(guān)鍵蛋白酶基因（prtB，oppD，pepC，pepF，pepQ，pepX，pepT）表達情況。

1 實驗

1.1材料與設(shè)備

菌種：由東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室分離保存的德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）KLDS 1.0207，1.0501，1.1007，1.9201，1.9203和1.0208。

試劑：復(fù)原脫脂乳，EDTA·2Na(Amresco)，鄰苯二甲醛，DEPC，鄰苯二甲醛，RNA prep pure培養(yǎng)細菌總RNA提取試劑盒，PrimerScript?RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒。

設(shè)備：離心機，PCR儀，電泳儀，紫外分光光度計，實時定量PCR儀。

1.2驗設(shè)計與方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌蛋白水解活力的測定

蛋白水解活力的測定參照Church[11]的鄰苯二甲醛（OPA）方法。將活化好的菌株按2%接種于滅菌脫脂乳中，37℃培養(yǎng)。每隔2 h取樣品2 mL，加入4 mL濃度為0.75 mol/L三氯乙酸溶液，漩渦混勻，6 000 g離心5 min。取150 μL上清液與3 mL OPA試劑混合并開始準確計時5 min，在340 nm波長下比色[12]。

1.2.2 實時熒光定量PCR的引物設(shè)計與合成

以16S rRNA作為管家基因[13-14]，根據(jù)GenBank提供的Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusATCC 11842的 DNA序 列（GenBank accession number:NC_ 008054.1）中相應(yīng)基因的序列，采用primer5.0軟件設(shè)計16S rRNA，prtB，oppD，pepC，pepF，pepQ，pepX和pepT基因的引物序列進行合成（見表1）。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.2.3 提取總RNA及其完整性和純度的檢測

在90 mL質(zhì)量分數(shù)為2%檸檬酸三鈉溶液中加入10 mL發(fā)酵乳，混合均勻后取10 mL懸浮液6 000×g離心5 min，溫度為4℃，除去上清液后對菌體進行收集[15]。根據(jù)RNAprep pure培養(yǎng)細菌總RNA提取試劑盒操說明書立即抽取樣品中的總RNA。

對樣品進行溴乙錠(EB)染色后，取3 μL提取的RNA和2 μL的Loadingbuffer點樣于質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳（150 V，5 min），通過CDS8000型凝膠分析系統(tǒng)成像后，觀察電泳條帶23 s和16 s的性狀判斷RNA的完整性。通過測定260 nm和280 nm處提取的RNA的吸光度，并計算OD260/OD280的比值來判定RNA的純度。

1.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

提取的總RNA利用PrimerScript?RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA樣本于-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩T反應(yīng)體系如表2所示。

表2 RT反應(yīng)體系

1.2.5 實時熒光定量PCR

采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Takara）和ABI7500 Fast Real-Time PCR System對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行實時熒光定量PCR測定。本實驗使用兩步法標準PCR擴增程序，反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL；ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL；PCR Forward Primer（10 μmol/ L）0.4 μL；PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL；cDNA模板（稀釋10倍）2 μL；RNase Free dH2O 6.8 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件為：95℃（30 s）預(yù)變性；95℃（5 s），60℃（34 s），40次循環(huán)PCR反應(yīng)。本實驗在不同體系樣品中重復(fù)3次。

1.2.6 不同初始pH值對基因表達的影響

在滅菌脫脂乳中接入活化后的6株菌各2%，滅菌脫脂乳的pH值分別為5.6，5.9，6.2，6.5。在37℃環(huán)境下發(fā)酵12 h后分別提取各樣本菌體的RNA。對提取的RNA進行完整性和濃度檢測，對樣品反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進行實時熒光定量PCR檢測，每組重復(fù)3次。

1.3實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析

對基因的CT值進行測定，利用2-△△CT法對目的基因的表達量進行評估。反應(yīng)中的每個目的基因和內(nèi)參基因在不同樣本重復(fù)3次，取平均值，從而計算標準差。

1.4驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

將每個待測樣品均重復(fù)3次，采用SPSS 16.0軟件進行方差分析，采用Duncan方法進行多重比較，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1保加利亞乳桿菌的蛋白水解曲線

圖1為保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力變化曲線。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力極顯著增強（P＜0.01），且其水解曲線的線性基本一致。蛋白水解活力最強的菌種為KLDS 1.9201，蛋白水解活力最弱的為KLDS 1.0207。以L-亮氨酸標準曲線計算（相當于亮氨酸）游離氨基酸的濃度，培養(yǎng)12 h時菌株KLDS 1.9201，1.0208，1.0501，1.9203，1.1007和 1.0207分 別 為384.33±0.001，255.50±0.000，181.50±0.002，164.15± 0.002，155.83±0.001和（92.17±0.002）mg/L。

圖1 蛋白水解活力變化曲線

2.2RNA的純度和完整性測定分析

由于RNA的純度和完整性關(guān)系到之后的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率和實時熒光PCR測定，因此，本實驗首先通過測定提取保加利亞乳桿菌各樣本RNA的OD260和OD280值來確定其純度，并通過1%瓊脂凝膠電泳來確定其完整性。實驗中測得的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，這表明所提取的RNA中沒有DNA和蛋白質(zhì)的殘留，純度較高。質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂凝膠電泳的結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，23S RNA和16S RNA條帶清晰，5S RNA條帶較暗，這一結(jié)果說明RNA樣品質(zhì)量完好，可用于后續(xù)試驗。

為進一步驗證總RNA的提取是否成功和引物特異性是否完好，對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA與管家基因和目的基因引物進行了普通PCR實驗和1%瓊脂凝膠電泳。結(jié)果顯示反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA未受污染，引物特異性良好（見圖3）。

圖2RNA電泳樣品結(jié)果

圖3 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA普通PCR電泳結(jié)果

2.3不同初始pH值對蛋白水解關(guān)鍵酶基因表達的影響

不同初始pH值對蛋白水解體系關(guān)鍵酶基因表達結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，總體上基因表達是隨著初始pH值的升高且上調(diào)的，其中菌株KLDS 1.0207和KLDS 1.1007的基因表達量隨著初始pH值升高的變化是先下調(diào)再上調(diào)，當初始pH值為5.6時表達量達到最高，初始pH值為6.2時表達量最低，初始pH值為6.5時表達量開始緩慢上調(diào)。在初始pH值為5.6進行培養(yǎng)時，菌株KLDS 1.0207和1.1007的prtB和oppD基因表達量最大；在初始pH值為5.9培養(yǎng)時，菌株KLDS 1.1007基因表達量最大；在初始pH值為6.2時，菌株KLDS 1.9201，1.9203和1.0208表達量最大；且與各自對照組相比分別上調(diào)18.86倍、2.22倍和6.60倍；在初始pH值為6.5時，菌株KLDS 1.0207和1.0501的pepC基因表達量和菌株KLDS 1.0501的基因表達量達到最大，且以上菌株與各自對照組（初始pH值為5.6）相比較都存在顯著差異（P＜0.05）。此外，菌株KLDS 1.0501，1.9201，1.9203和1.0208中pepQ和pepT基因在高初始pH值時表達量顯著高于低初始pH值時的表達量（P＜0.05）。

圖4 不同初始pH值培養(yǎng)下關(guān)鍵酶基因的相對表達

3 討論

雖然乳酸菌不能直接利用外源蛋白，但其自身具有高效的蛋白水解體系，能夠為其生長代謝提供足夠的游離氨基酸，從而改善機體對發(fā)酵乳中乳蛋白的吸收和利用，同時還賦予了發(fā)酵乳制品更高的營養(yǎng)價值。Gilbert等[16]研究表明乳桿菌屬在脫脂乳中的生長狀態(tài)更好，且乳酸桿菌的蛋白水解能力明顯高于乳酸球菌；黃昌良等[17]發(fā)現(xiàn)單從菌落總數(shù)來說，以乳清加6%脫脂奶粉作為培養(yǎng)基最好；周德慶[18]發(fā)現(xiàn)其生長繁殖過程中需要多種維生素等生長因子，尤其是B族維生素，如吡哆酸、谷氨酸、葉酸等。Rina Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MRS基質(zhì)的pepP基因在低pH值（2.5）時的表達水平低于高pH（6.4）的表達水平。劉桂芳等[20]在蛋白水平上研究發(fā)現(xiàn)，在不同pH條件下不同菌株水解酪蛋白的能力存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著初始pH值的升高，保加利亞乳桿菌KLDS 1.0501、1.9201、1.9203和1.0208的prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX和pepT基因表達量均上調(diào)，部分基因在pH值為6.5時部分基因的表達量能夠繼續(xù)上調(diào)。這可能是由于初始pH值為6.2和6.5是菌體生長繁殖的最適pH值，可使菌體快速進入對數(shù)期或者穩(wěn)定期；另外，初始pH值為5.6和5.9會抑制菌體生長，使菌體緩慢生長。本文研究結(jié)果與劉桂芳等的研究結(jié)果一致。Stressler等[21]研究了溫度和pH值對Lactobacillus helveticusATCC 12046的pepX和pepN的活性和熱穩(wěn)定的影響，發(fā)現(xiàn)pepX在40～50℃之間和pH值為6.0～7.0之間活性較高。因此，保加利亞乳桿菌蛋白水解活力和蛋白水解體系關(guān)鍵酶基因的表達水平存在顯著差異，這可能受生長環(huán)境pH值和自身生物學特性的影響。

另外，隨著培養(yǎng)體系pH值降低至一定值，菌體胞內(nèi)pH值的動態(tài)平衡被破壞，胞內(nèi)pH值隨之降低，則菌體將無法正常生長和代謝，甚至死亡，同時菌體代謝物的產(chǎn)量也受到影響，即菌體生長受抑制程度還與菌株的特性息息相關(guān)[22]。保加利亞乳桿菌屬同型發(fā)酵性乳酸菌，馬靜等[23]認為pH值是影響乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的重要因素之一，培養(yǎng)基的初始pH值和控制培養(yǎng)過程中的pH值都會影響胞外多糖的最終產(chǎn)量。王立平[24]等認為菌株水解酪蛋白的能力受pH值的影響，在酪蛋白和菌株共培養(yǎng)過程中，Lactobacillus helveticus9水解酪蛋白時產(chǎn)生的一定量的氨基酸殘基會降低酪蛋白水解液的pH值，通過滴加NaOH溶液調(diào)節(jié)酪蛋白溶液的pH值，使菌體的蛋白酶維持在較適pH值范圍內(nèi)，可以提高菌株蛋白水解度，這樣有利于多肽的生成。

本文就初始pH對保加利亞乳桿菌蛋白水解體系相關(guān)基因表達水平的影響進行了初步探討，但是菌體在脫脂乳中生長時，可產(chǎn)生乳酸及少量的醋酸、丙酸、酪酸、異戊酸、己酸、辛酸和癸酸等揮發(fā)性酸[25-28]。脫脂乳體系的pH會隨著乳酸、氨基酸殘基和有機酸等代謝產(chǎn)物的增加而變化，從而影響蛋白酶基因的表達和蛋白酶的活性。因此，在恒定pH值環(huán)境下培養(yǎng)菌體，其蛋白酶基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達和在蛋白水平的活性有待進一步研究。

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Effect of different initial pH on gene expressions of key proteolytic enzyme of Lactobacillus bulgaricus

ZHANG Hongchao1，PANG Shiyue1，WANG Haimei1，HAN Weiwei2，JIANG Zhanmei1，DU Peng1，HOU Juncai1
(1.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2. Harbin Fengrui Shengwukeji Co.Ltd.,Harbin 150036,China)

Lactic acid bacteria(LAB)obtain all the necessary small peptides and free amino acids by their complex proteolytic system,because LAB itself can not directly use the exogenous proteins.In this study,six Lactobacillus bulgaricu strains(KLDS 1.0207,1.0501,1.1007,1.9201, 1.9203,and 1.0208)which had different initial pH values(5.6,5.9,6.2,6.5)incubated in skim milk were to analyze the dynamic changes of the genes expressions of the key proteinase(prtB,oppD,pepC,pepF,pepQ,pepX and pepT)at the mRNA transcription level using the real-time quantitative PCR technique.The effects of initial pH on key proteolytic enzyme genes expression among the six strains was significant(P＜0.05),it was up-regulated that the genes expression of the key proteolytic enzyme for the strains KLDS 1.0501,1.9201,1.9203 and 1.0208 with the increase of initial pH in skim milk.Meanwhile,some genes increased continuously at the initial pH6.5,significant differences in which are also observed.

Lactobacillus bulgaricus;proteolytic system;gene expression;real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR)

Q933

A

1001-2230（2017）02-0008-04

2016-07-01

黑龍江省新世紀人才項目資助（1253-NCEF-006）。

張鴻超（1992-），女，碩士，研究方向為食品工程。

侯俊財