田玉路，王宏俠，高 萌，趙麗麗，張?zhí)m桐，王 巧

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017)

·論 著·

高效液相色譜法測(cè)定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量

田玉路，王宏俠，高 萌，趙麗麗，張?zhí)m桐，王 巧*

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017)

目的對(duì)前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素常用的高效液相色譜法含量測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，用于市售前胡的分析。方法改用甲醇作為提取溶劑，超聲處理時(shí)間為30 min，提取液直接測(cè)定分析。采用Thermo ODS HYPERSIL色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，以甲醇-水(68∶32)為流動(dòng)相。結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素分別在5.00～400.00 mg/L和0.50～40.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99)和Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99)，精密度為0.6%～2.0%，加樣回收率為90.7%～104.8%。采用建立的方法對(duì)9批市售前胡進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)論該方法更簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，可準(zhǔn)確測(cè)定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素。

前胡；白花前胡甲素；白花前胡乙素；高效液相色譜法

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根，具有降氣化痰、散風(fēng)清熱的功效，主要用于治療痰熱喘滿、咯痰黃稠、風(fēng)熱咳嗽痰多等癥[1]，其主要化學(xué)成分為香豆素類(lèi)化合物[2-4]，文獻(xiàn)報(bào)道香豆素類(lèi)化合物具有多方面的藥理作用[5-16]。目前常通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)[1，17-19]，采用白花前胡甲素和白花前胡乙素作為定量指標(biāo)控制前胡的質(zhì)量。這些方法制備供試品溶液時(shí)常采用三氯甲烷作為提取溶劑，溶劑毒性較大，并且有溶劑揮干過(guò)程，操作較繁瑣，條件不易控制。為此，本研究對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素的高效液相色譜法含量方法進(jìn)行改進(jìn)，以期為前胡質(zhì)量控制提供一簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、環(huán)境又好的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 1200系列高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，包括四元泵(G1311A)，自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329A)，VWD檢測(cè)器(G1314B)，DAD檢測(cè)器(G1315D)，在線脫氣機(jī)(G1322A)以及柱溫箱(G1316A)；KQ5200E型超聲波清洗器(功率200 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；PW系列超純水系統(tǒng)(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)。

1.2 試藥 白花前胡甲素(批號(hào)：111711-200602)和白花前胡乙素(批號(hào)：111904-201203)對(duì)照品均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。水為超純水，甲醇為色譜純(美國(guó)天地有限公司)和分析純(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。9批前胡分別收集于不同地區(qū)，并經(jīng)河北省食品藥品檢驗(yàn)研究院段吉平主任藥師進(jìn)行生藥學(xué)鑒定。各樣品均由FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，粉末過(guò)3號(hào)篩保存于干燥器內(nèi)備用。

1.3 色譜條件 Thermo ODS HYPERSIL色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(68∶32)；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。對(duì)照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜法色譜圖見(jiàn)圖1。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取白花前胡甲素和白花前胡乙素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成含白花前胡甲素400 mg/L和白花前胡乙素40 mg/L的混合對(duì)照品溶液，過(guò)微孔濾膜(0.45 μm)，即得。

1.4.2 供試品溶液的制備 取前胡粉末約0.1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)微孔濾膜(0.45 μm)，即得供試品溶液。

圖1 對(duì)照品和樣品高效液相色譜法色譜圖

A.對(duì)照品；B.樣品；1.白花前胡甲素；2.白花前胡乙素

Figure 1 The high performance liquid chromatography chromatograms of standard and sample solution

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值，考察儀器重復(fù)性。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 將混合對(duì)照品溶液依次用甲醇稀釋?zhuān)玫椒謩e含白花前胡甲素400、200、100、50、10、5 mg/L；白花前胡乙素40、20、10、5、1、0.5 mg/L的系列混合對(duì)照品溶液，過(guò)微孔濾膜(0.45 μm)，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液10 μL進(jìn)樣分析，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)用加權(quán)最小二乘法(W=1/X)進(jìn)行一元線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度按如下公式計(jì)算：相對(duì)誤差(relative error，RE)(%)=(回歸濃度-實(shí)際濃度)/實(shí)際濃度×100%。

1.5.3 檢測(cè)限與定量限 將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋并進(jìn)行測(cè)定，以信噪比(signal-noise ratio，S/N)=3和S/N=10時(shí)分析物的濃度為檢測(cè)限和定量限。

1.5.4 精密度試驗(yàn) 按供試品溶液的制備方法，平行制備6份，連續(xù)重復(fù)3 d，測(cè)定含量，計(jì)算日內(nèi)精密度RSD值和日間精密度RSD值，考察方法的精密度。

1.5.5 回收率試驗(yàn) 取前胡粉末，精密稱(chēng)定9份(各0.050 g)，分別精密加入同一濃度混合對(duì)照品溶液2.5、5.0、7.5 mL，各平行3份，精密加入甲醇補(bǔ)足至10 mL，按供試品溶液的制備方法，制備溶液，測(cè)定分析物的含量并計(jì)算回收率。加樣回收率按如下公式計(jì)算：(測(cè)得量-藥材中量)/加入量×100%。

1.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于室溫放置0、12、24 h時(shí)進(jìn)樣分析，測(cè)定分析物的濃度，考察方法的穩(wěn)定性。

1.5.7 樣品測(cè)定 分別取各前胡樣品制備供試品溶液，并注入液相色譜儀測(cè)定白花前胡甲素和白花前胡乙素的峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的RSD分別為0.4%和0.5%，表明該儀器重復(fù)性良好。回歸方程為：白花前胡甲素Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99)線性范圍5.00～400.00 mg/L；白花前胡乙素Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99)，線性范圍0.50～40.00 mg/L。白花前胡甲素和白花前胡乙素各濃度點(diǎn)的RE值為-0.8%～1.0%。白花前胡甲素和白花前胡乙素的檢測(cè)限分別為0.039 7 mg/L和0.103 7 mg/L，定量限分別為0.198 5 mg/L和0.518 4 mg/L。白花前胡甲素的日內(nèi)與日間精密度分別為0.9%和2.0%；白花前胡乙素的日內(nèi)與日間精密度分別為0.6%和1.4%。加樣回收率為90.7%～104.8%，回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，2。穩(wěn)定性結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)濃度差異的RSD均<2.0%，表明該法穩(wěn)定性良好。

2.2 樣品測(cè)定 白花前胡甲素的含量為0.73%～2.24%，白花前胡乙素的含量為0.12%～0.33%，見(jiàn)表3。

表1 白花前胡甲素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 白花前胡乙素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 前胡樣品中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 提取方法 《中國(guó)藥典》(2015年版)與文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]常采用三氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為了避免提取溶劑三氯甲烷對(duì)色譜系統(tǒng)的影響，在制備供試品溶液時(shí)需要先將三氯甲烷除去，因此常涉及溶液的揮干、轉(zhuǎn)移操作，致使方法繁瑣。另外，因方法中有濾過(guò)操作，由于三氯甲烷的強(qiáng)揮發(fā)性，往往使過(guò)濾前后溶液濃度易發(fā)生改變，條件不易控制，且三氯甲烷具有較明顯的毒性。

針對(duì)以上問(wèn)題，本研究嘗試通過(guò)改變提取溶劑進(jìn)行方法改進(jìn)。依照方法，比較了常用提取溶劑氯仿、甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮對(duì)2種成分的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯仿和乙醚分別對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素具有最高的提取效率，甲醇對(duì)白花前胡甲素的提取僅次于氯仿，無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮對(duì)白花前胡甲素均不能有效提取，甲醇和乙醚對(duì)白花前胡乙素的提取效率相近。因此本研究選擇甲醇替代氯仿作為提取溶劑，既避免了溶劑的強(qiáng)揮發(fā)性對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，也因?yàn)榧状寂c反相色譜適用而省去揮干溶劑的過(guò)程。

為了達(dá)到最佳提取效率，考察了不同超聲時(shí)間(10、20、30、40、50 min)，結(jié)果顯示，超聲30 min時(shí)白花前胡甲素和白花前胡乙素的提取效率最高。為了考察是否提取完全，將提取后殘?jiān)眉状枷磧簦龠M(jìn)行第2次提取，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，第2次提取液中白花前胡甲素峰面積占第1次提取液中峰面積的0.045 4%，且未檢測(cè)到白花前胡乙素峰，故可認(rèn)為甲醇超聲提取30 min可達(dá)到完全提取。

3.2 色譜條件 本研究初期嘗試了DIKMA Diamonsil C18(2)(4.6×250 mm，5 μm)、Purospher STARLP RP-18 endcapped(4.6×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)和Thermo ODS HYPERSIL(4.6×250 mm，5 μm) 4種色譜柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于白花前胡甲素，白花前胡乙素易受到其他色譜峰的干擾，僅在一種色譜柱上達(dá)到良好分離效果，在其他色譜柱上不僅無(wú)法分離，且易與相鄰峰合并為一個(gè)色譜峰，即使改變流動(dòng)相比例也無(wú)法改善。如此，其他色譜峰產(chǎn)生的峰面積也易按白花前胡乙素計(jì)，致使白花前胡乙素測(cè)定結(jié)果偏高，產(chǎn)生較大誤差。根據(jù)以上結(jié)果可以看出，白花前胡甲素和白花前胡乙素2種成分的測(cè)定對(duì)色譜柱的要求較嚴(yán)格，尤其是后者，因此，對(duì)2種成分測(cè)定時(shí)應(yīng)選擇合適的色譜柱，并注意峰分離情況。

3.3 改進(jìn)方法與藥典方法比較 本研究以《中國(guó)藥典》(2015年版)中記載的方法為例，與改進(jìn)方法的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較?？梢钥闯鲇?批樣品的含量測(cè)定結(jié)果改進(jìn)方法略高于藥典方法，說(shuō)明本研究方法顯示出較高的提取效率。改進(jìn)方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，且首次注意到白花前胡乙素在色譜分離時(shí)出現(xiàn)的峰包合現(xiàn)象，可用于前胡的質(zhì)量控制。

3.4 市售前胡樣品質(zhì)量分析 《中國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定前胡樣品按干燥品計(jì)算，含白花前胡甲素不得少于0.90%，含白花前胡乙素不得少于0.24%。改進(jìn)方法樣品測(cè)定結(jié)果可知，采集的9批樣品中僅有一批樣品(樣品1)2種成分含量都合格，白花前胡甲素合格或白花前胡乙素合格的各有4批樣品。若按《中國(guó)藥典》(2015年版)中規(guī)定的含量測(cè)定方法測(cè)定，同樣是不合格的結(jié)果。以上結(jié)果初步說(shuō)明，市售前胡樣品合格率極低，且各批次間的含量測(cè)定結(jié)果偏差較大，提示前胡質(zhì)量和市場(chǎng)亟待有效控制和管理。

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(本文編輯：趙麗潔)

Determination of contents of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix by high performance liquid chromatography

TIAN Yu-lu, WANG Hong-xia, GAO Meng, ZHAO Li-li, ZHANG Lan-tong, WANG Qiao*

(DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,theSchoolofPharmacy，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To improve the method for the determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix by high performance liquid chromatography. Then the method was used for the analysis of commercial “Qian Hu”. Methods Methanol was used as the extraction solvent and ultrasonic extraction time was 30 min. The extract was analyzed directly. The separation was performed on a Thermo ODS HYPERSIL(4.6×250 mm, 5 μm) column using methanol and water(68∶32) as mobile phase. Results The methodology validation presented that praeruptorin A and praeruptorin B were in good correlation in the range of 5.00-400.00 mg/L and 0.50-40.00 mg/L with the regression equations of Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99) and Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99), respectively. The results of the precision (RSD) and recoveries were in the range of 0.6%-2.0% and 90.7%-104.8%, respectively. Nine batches of commercial “Qian Hu” were determined by the established method. Conclusion The method is simpler, more rapid and more reproducible. It can be used for the accurate determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix.

Peucedani Radix; praeruptorin A; praeruptorin B; high performance liquid chromatography

2016-03-11；

2016-04-08

田玉路(1989-)，女，河北曲陽(yáng)人，河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院理學(xué)碩士研究生，從事藥物質(zhì)量控制研究。

*通訊作者。E-mail：qiaowang88@hotmail.com

R917

A

1007-3205(2017)03-0331-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.020