張洋洋，陳良安

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 承德 067000；2.中國人民解放軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100853)

·論 著·

SD大鼠腹腔脂肪干細胞分離培養(yǎng)和鑒定

張洋洋1，陳良安2

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 承德 067000；2.中國人民解放軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100853)

目的建立一種有效的分離、培養(yǎng)SD大鼠腹腔脂肪干細胞(adipose tissue-derived stem cells，ASCs)的方法，從而為大鼠間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的來源提供更廣闊的選擇。方法取4周齡雄性SD大鼠的腹腔脂肪組織，經(jīng)0.1%Ⅰ型膠原酶消化，離心、洗滌后間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基重懸，置于細胞孵箱中培養(yǎng)，長至80%融合后用0.25%胰酶-EDTA消化、傳代培養(yǎng)，繪制細胞生長曲線，進行細胞形態(tài)、表面標志、成骨及成脂分化潛能鑒定。結果ASCs貼壁生長，原代ASCs呈短小梭形，經(jīng)傳代后和培養(yǎng)時間的延長，細胞變?yōu)殚L梭形，旋渦狀排列。培養(yǎng)第2、4、5、6 d時，第5代的ASCs A值低于第3代，第8代的ASCs A值低于第3代和第5代，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ASCs陽性表達CD29、CD54、CD90.1，不表達CD31、CD45、CD106。結論通過貼壁培養(yǎng)可以從SD大鼠腹腔脂肪組織分離培養(yǎng)出高純度的ASCs，此種方法獲得的ASCs增殖速度快，可以成為SD大鼠MSC的來源。

間質(zhì)干細胞；細胞培養(yǎng)；生長曲線；脂肪組織；大鼠

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種來源于中胚層的成體干細胞,這類細胞具有高度的自我更新能力，能夠向外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三系分化，廣泛存在于全身結締組織和各個器官間質(zhì)中。MSCs具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和分泌促進組織修復的各種因子等作用，因此在再生醫(yī)學和臨床應用方面有著巨大的潛能[1-4]。脂肪源性的干細胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)為MSCs的一種，因脂肪來源豐富，并且易于獲得以及純化，目前已成為成體干細胞研究的理想來源之一。SD大鼠是較為廣泛的基礎實驗的動物模型之一。目前大鼠ASCs的分離主要應用腹股溝脂肪組織，本研究擬建立簡單、高效的SD大鼠腹腔ASCs分離培養(yǎng)方法，并對所獲得的細胞進行鑒定，旨在為后續(xù)實驗做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 4周齡健康雄性SD大鼠4只，體質(zhì)量60～80 g，無特定病原體實驗動物(specific pathogen free,SPF)級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。MSCs專用培養(yǎng)基(美國Sciencell公司)；Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)；細胞表面熒光標記抗體(德國Miltenyi Biotec公司)；成骨誘導分化培養(yǎng)基、成脂誘導分化培養(yǎng)基(塞業(yè)廣州生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 實驗方法 SD大鼠ASCs的分離培養(yǎng)：將4周齡雄性SD大鼠頸椎脫臼處死，浸于75%乙醇中消毒皮膚10 min。將SD大鼠以仰臥位置于超凈操作臺上，用手術剪無菌條件下逐層剪開腹部皮膚、肌肉，暴露腹腔，剪取腎臟周圍、附睪周圍及腹后外側脂肪組織，置于玻璃皿中，用無菌預冷的PBS反復沖洗3次，去除肉眼可見的血管和纖維成分。將脂肪組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊，移入錐形瓶中，加入10倍脂肪體積的0.1% Ⅰ型膠原酶，于37 ℃恒溫水浴中振蕩消化30 min，將消化后的懸液移入離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS洗滌1遍，再次離心后棄上清，用間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基重懸沉淀，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至1×105/cm2，之后將細胞懸液接種于60 mm培養(yǎng)皿，置于37 ℃體積分數(shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3 d進行1次換液。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況，約80%融合時，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化，約1 min細胞回縮變圓，加入間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，移液槍吹打混勻后以1∶3傳代培養(yǎng)，傳代后次日換液，以后每3 d換液1次。用倒置相差顯微鏡逐日觀察原代及傳代ACSs形態(tài)，并拍照記錄。

ASCs增殖能力檢測：取第3代、第5代及第8代ASCs，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，移液槍吹打混勻后計數(shù)，以1×103個/200 μL/孔接種于96孔板，含4個復孔，置于37 ℃體積分數(shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每天取出1塊96孔板，共7 d，每孔中加入20 μL MTT，置于細胞孵箱中孵育4～6 h后吸除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min，490 nm酶標儀測定吸光度(A值)，繪制細胞生長曲線。

ASCs表面抗原鑒定：取融合達80%的第5代ASCs，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸，巴氏吸管反復吹打制成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×106個/1.5 mL，然后分裝入EP管，每份檢測樣本細胞數(shù)不低于1×106個，1 000 r/min離心10 min后45 μL PBS重懸，分別加入CD29-FITC、CD31-PE、CD45-FITC、CD54-PE、CD90.1-FITC、CD106-PE，各5 μL，設陰性對照，4℃避光孵育10 min，PBS洗滌2遍以去除未結合的抗體，使用流式細胞儀進行檢測。

ASCs成骨誘導及鑒定：取第3代ASCs，消化后接種于6孔板，待細胞長至80%融合，換用成骨誘導培養(yǎng)基，每2 d換液1次。誘導7 d后行茜素紅染色，在倒置顯微鏡下進行觀察和拍照。

ASCs成脂誘導及鑒定：取第3代ASCs，消化后接種于6孔板，待細胞長至80%融合，組換用成脂誘導培養(yǎng)基，每2 d換液1次。誘導7 d后行油紅O染色，在倒置顯微鏡下進行觀察和拍照。

1.3 主要觀察指標細胞形態(tài)學，細胞生長情況，流式細胞表面標志物鑒定及成骨細胞、成脂細胞誘導分化。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ASCs形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下直接觀察，原代細胞2 d首次換液，可見少量短小梭形細胞貼壁。隨著培養(yǎng)時間延長，可觀察到細胞集落逐漸增大，7～10 d可傳代，傳代后細胞呈長梭形，旋渦狀排列。見圖1，2。

2.2 ASCs增殖活性測定 從生長曲線可見ASCs細胞在培養(yǎng)1、2 d為潛伏期，2～4 d為對數(shù)生長期，4～7 d為衰退期。細胞活性測定：培養(yǎng)1、3 d時，第3代、第5代、第8代ASCs吸光度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；培養(yǎng)2、4、5、6 d時，第5代的ASCs吸光度低于第3代，第8代的ASCs吸光度低于第3代和第5代，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3，表1。

表1 第3代、第5代、第8代ASCs不同培養(yǎng)時間吸光度值變化

*P<0.05與第3代比較 #P<0.05與第5代比較(q檢驗)

2.3 ASCs表面標志檢測 經(jīng)流式細胞儀檢測，CD29、CD31、CD45、CD54、CD90.1、CD106的表達率分別為99.93%、0.46%、0.32%、99.84%、96.31%、2.76%，即ASCs陽性表達CD29、CD54、CD90.1，不表達CD31、CD45、CD106。

2.4 ASCs成骨誘導及鑒定 加入成骨誘導培養(yǎng)基后細胞逐漸停止擴增，出現(xiàn)礦化物，第7天進行茜素紅染色為陽性，見圖4。

2.5 ASCs的成脂誘導及鑒定 加入成脂誘導培養(yǎng)基后，細胞逐漸回縮變?yōu)閳A形、橢圓形，第3天部分細胞可見較小脂滴，第7天時脂滴明顯變大、增多，油紅O染色陽性，見圖5。

3 討 論

Friedenstein等[5]在1968年首次于骨髓中分離出了MSCs，早期的相關研究主要集中應用骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs分離步驟復雜、耗時長，且目前普遍應用的貼壁培養(yǎng)法較難得到高純度的BMSCs。應用流式細胞儀進行分選，BMSCs會被高能激光以及機械剪切力損傷，導致分離的細胞活性較低。免疫磁珠分選法可獲得較高純度的BMSCs，但操作過程復雜，而且費用很昂貴。骨髓中MSCs含量很少，每毫升的骨髓中僅能獲得100～1 000 CFU-F，隨著年齡增長數(shù)量進一步減少，如果應用于臨床可能需反復穿刺，給患者帶來痛苦，因此BMSCs的臨床應用受到限制。

2001年Zuk等[6]首次從人吸脂術的脂肪中分離培養(yǎng)出了ASCs，此后ASCs的分離和純化技術不斷改進，300 mL脂肪抽吸術獲得的脂肪可以分離出1×107個ASCs，而且純度高達95%[7]。脂肪組織來源充分，局部麻醉后即可抽吸脂肪，獲取方便，而且ASCs的分離過程簡單[8]，增殖速度快，臨床應用不存在倫理學爭議，已成為當今干細胞研究領域的熱點種子細胞之一。ASCs與BMSCs在體外三系分化潛能和基因表達譜方面均沒有明顯差異[9]。ACSs雖具有多向分化潛能，但截至目前尚無研究發(fā)現(xiàn)其有致瘤風險，因此具有較好的安全性。ASCs不表達Ⅱ類主要組織相容性復合體[10]，具有低免疫原性、低免疫調(diào)節(jié)功能，移植排斥反應發(fā)生率低[11]，除了適用于自體移植外，還可以用于同種異體移植，因此在移植治療上具有顯著優(yōu)勢。ASCs治療疾病的相關研究大量涌現(xiàn)，如治療心肌梗死、腦梗死、糖尿病、急性肺損傷、骨折、燒傷、脊髓損傷、肝硬化、急性和慢性腎損傷、系統(tǒng)性硬化癥、乳腺癌術后乳腺重建等[12-19]。ASCs的具有良好的臨床應用前景，目前僅于美國國立圖書館臨床試驗注冊中心注冊的ASCs治療相關的臨床試驗就已多達30余項。近些年，一系列動物實驗證實MSCs外分泌體在腦卒中、心肌缺血再灌注損傷、藥物性肝損傷等動物模型中有類似于MSCs的治療作用[20-22]，提取外分泌體需要大量的MSCs，而ASCs來源充分及獲取方便，成為外分泌體研究的可靠細胞來源。但ASCs作為一種生物治療手段，在大規(guī)模應用到投入到臨床使用前，仍需對其有效性、安全性、詳細的治療機制等進行深入研究，對一些目前尚缺乏有效治療措施的少見病、罕見病也可以考慮是否能將MSCs作為一種治療手段，而這些研究仍依賴于大量的動物基礎實驗。

SD大鼠是基礎研究最為常用的實驗動物之一，目前大鼠ASCs的分離主要應用腹股溝脂肪組織，但該部位的脂肪組織富含血管和淋巴結，分離過程中不易去除，腹腔脂肪組織的細胞種類則相對單一。大鼠的年齡是決定ASCs分離成敗的關鍵因素之一。本研究選取4周齡雄性SD大鼠，分離腹腔脂肪組織，獲得的ASCs形態(tài)較為一致，傳代至第8代仍有較好的形態(tài)和較快的增殖速度；但相比而言，第3代較第5代和第8代的活性更高。

脂肪組織中包括前脂肪細胞、成熟脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及成纖維細胞等多種細胞。ASCs是脂肪組織中具有多向分化潛能的細胞，通過膠原酶消化脂肪組織可獲得，目前尚缺乏特異性的細胞表面標記物。ASCs的鑒定需結合細胞形態(tài)、貼壁性、細胞表面標志及多向分化潛能等進行綜合判斷，ASCs區(qū)別于BMSCs的特點之一是CD106表達陰性[23]。本研究采用37 ℃恒溫水浴條件下應用Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織，從脂肪組織中分離的梭形、貼壁細胞進行傳代培養(yǎng)，傳至第3代進行成脂和成骨誘導分化，經(jīng)油紅O、茜素紅染色鑒定誘導成功，傳至第5代進行細胞表面抗原流式鑒定，CD29、CD54、CD90.1為陽性，CD31、CD45、CD106為陰性。與文獻報道相符[24]。

綜上所述，本研究選取4周齡雄性SD大鼠，分離腹腔脂肪組織，經(jīng)0.1% Ⅰ型膠原酶于37 ℃進行消化，30 min后離心、洗滌，MSCs專用培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿，置于37 ℃體積分數(shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，經(jīng)傳代培養(yǎng)，可獲得高純度、高增殖速率的ASCs，可作為SD大鼠MSCs應用于實驗研究。(本文圖見封三)

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(本文編輯：劉斯靜)

Isolation, culture and identification of adipose tissue-derived stem cells from Sprague Dawley rat's abdominal cavity

ZHANG Yang-yang1, CHEN Liang-an2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,HeibeiProvince,Chengde067000,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China)

Objective To establish an effective and simple method for isolation and expansion of the adipose tissue-derived stem cells(ASCs), by using the adipose tissues of abdominal cavity of Sprague Dawley rat, and to provide another choice for cell source of mesenchymal stem cells(MSCs). Methods The adipose tissues were obtained from the abdominal cavity of Sprague Dawley rats aged 4 weeks. 0.1% collagenase Ⅰ was chosen for digesting the adipose tissues. After washing and centrifugation, the cells were re-suspended in mesenchymal stem cell medium and cultured in cell incubator. The growth rate was assessed by MTT assay. ASCs were then verified by the flow cytometry analysis and differentiation assays. Results ASCs were spindle-like in shape and adhered to the plastic tissue culture medium, with high multiplication rate. The absorbance value of passage 5 was lower passage 3, and the absorbance value of passage 8 was lower than passage 3 and passage 5 on day 2, 4, 5 and 6(P<0.05). ASCs were positive for CD29, CD54 and CD90.1, but negative for CD31, CD45 and CD106. Conclusion ASCs can be effectively isolated and expanded from the adipose tissues of abdominal cavity of Sprague Dawley rat, by using adherent culture. And ASCs from adipose tissues of abdominal cavity may be a good multipotential cell candidate for future cell replacement therapy.

mesenchymal stem cells; cell culture technique; growth charts; adipose tissue; rats

2016-01-21；

2016-02-17

張洋洋(1983-)，女，河北承德人，承德醫(yī)學院附屬

R332

A

1007-3205(2017)03-0258-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.003

醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事呼吸內(nèi)科疾病診治研究。