喻歡歡+吉光見稚代+胥秀英+鄭一敏+李隆云

[摘要]采用pNPG法測定玄參中β葡萄糖苷酶的活性，通過單因素及均勻設計實驗對提取液的種類、反應體系、反應時間、溫度、以及底物濃度等提取條件與反應條件進行了篩選，并在此基礎上測定了新鮮玄參在40～100 ℃干燥溫度中酶活性的變化。結果顯示，檸檬酸磷酸緩沖液提取效果較好，50 ℃環(huán)境下反應30 min時酶促反應產(chǎn)生的吸光度最大，均勻設計實驗確定最佳提取液pH 70、酶反應體系pH 60、底物濃度20 mmol·L-1。酶活性變化受干燥溫度和失水率影響，60～100 ℃干燥過程中溫度升高，隨著失水率加快酶活性迅速下降，而40，50 ℃干燥過程中一定的酶活性始終存在。該研究為環(huán)烯醚萜苷類水解機制和最佳干燥工藝的研究奠定了理論基礎。

[關鍵詞]玄參； β葡萄糖苷酶； 提取條件； 活性測定條件

Investigate optimum conditions and determinate changes of βglucosidase

activity in Scrophularia root under different drying conditions

YU Huanhuan1， YOSHIMITSU Michiyo1， XU Xiuying1， ZHENG Yimin1， LI Longyun2*

（1. School of Pharmacy and Bioengineering， Chongqing University of Technology， Chongqing， 400054；

2. Chonqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing， 400065）

[Abstract]To explore the optimum conditions of βglucosidase activity in Scrophularia root by using pNPG method The extraction conditions and reaction conditions （such as extraction liquid type， reaction system， reaction time， temperature， and substrate concentration） were screened by using monofactorial experiment and homogeneous design Then the changes of βglucosidase activity in Scrophularia root were detected at the drying temperature of 40100 ℃ The results showed that citric acid phosphate buffer had better extraction effect， and the maximum absorbance produced by enzymatic reaction was present at 50 ℃ environment after reaction for 30 min Homogeneous design experiment determined that the optimal conditions were as follows： optimal extraction liquid pH 70； enzymatic reaction system pH 60； substrate concentration 20 mmol·L1 The change of enzyme activity was affected by drying temperature and water loss rate In the drying temperature of 60100 ℃， the enzyme activity was reduced rapidly with the increase in water loss rate， while the activity was seen even with 0% of water at 40 and 50 ℃ This study has laid the theoretical foundation for research of hydrolysis mechanism of iridoid glycosides and optimum drying process

[Key words]Scrophularia root； βglucosidase activity； extraction conditions； activity testing conditions

玄參為玄參科植物Scrophulariacese玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，是具有涼血滋陰、泄火解毒等功效的傳統(tǒng)中藥材[1]，主要成分為哈巴苷、哈巴俄苷、桃葉珊瑚苷與O甲基梓醇等環(huán)烯醚萜苷類。環(huán)烯醚萜苷類極易氧化或水解，并且環(huán)烯醚萜類苷鍵水解斷裂和氧化聚合所生成的苷元很不穩(wěn)定，同時引起顏色的變化[23]。在中藥材干燥加工過程中，酶活性的變化是引起藥材性味及化學成分發(fā)生轉化的重要原因。據(jù)文獻報道，在玄參不同炮制方法的研究中發(fā)現(xiàn)，水解酶活性對玄參中主要成分哈巴俄苷的含量具有潛在影響[45]，哈巴俄苷在干燥過程中可能使其肉桂?；猓?產(chǎn)生哈巴苷和肉桂酸[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)哈巴苷、哈巴俄苷、桃葉珊瑚苷等環(huán)烯醚萜類化合物經(jīng)β葡萄糖苷酶水解后具有抗炎活性[79]?？梢娦⒏稍镞^程中藥材內在成分變化復雜，從而影響外觀顏色以及藥物功效。目前對于酶活性影響環(huán)烯醚萜苷水解機制的實驗數(shù)據(jù)尚未見報道，闡明藥材初加工過程中影響成分變化的機制，涉及到對干燥環(huán)境的合理控制，對提高玄參藥材質量和穩(wěn)定性具有重要意義。

本課題組圍繞玄參在干燥過程中水解酶β葡萄糖苷酶的變化情況，以及在初加工過程中它對玄參藥材質量的影響展開研究。本文首先采用β葡萄糖苷酶催化對硝基苯基βD葡萄糖苷（pNPG）法建立玄參中β葡萄糖苷酶活性測定方法，主要進行酶活性測定條件的探討[10]，并根據(jù)篩選出的條件，考察不同干燥溫度對玄參中的β葡萄糖苷酶活性的影響，為闡明玄參中的環(huán)烯醚萜苷類水解機制、尋找最佳干燥工藝提供理論依據(jù)。

1材料

2015年11月采于武隆仙女山玄參栽培基地，重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定，玄參S ningpoensis的新鮮根。

對硝基苯βD葡萄糖苷（SigmaAldrich公司，批號BCBP2339V），對硝基苯酚（上海強順化學試劑有限公司，批號20100121），檸檬酸（成都市科龍化工試劑廠，分析純），磷酸氫二鈉（廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心，分析純），檸檬酸鈉（成都市科龍化工試劑廠，分析純），碳酸鈉（成都市科龍化工試劑廠，分析純），雙重蒸餾水。

全波長酶標儀（51119300，美國賽默飛）；離心機（Eppendorf AG 22331 Hamburg德國艾本德）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP9082，上海一恒科技有限公司）；鼓風干燥箱（DHG9123A，上海龍躍儀器設備有限公司）；電子天平（千分之一，JA1003N，上海精密科學儀器有限公司）；攪拌機（JYLC02V，九陽股份有限公司）。

2方法

21試劑制備

檸檬酸緩沖液：將01 mol·L-1檸檬酸溶液加入檸檬酸鈉，測定其pH，即可；檸檬酸磷酸緩沖液：將01 mol·L-1檸檬酸溶液加入磷酸氫二鈉，測定其pH，即可；底物：緩沖液加入pNPG溶液；停止液：1 mol·L-1碳酸鈉溶液常規(guī)配制；對硝基苯酚標準液：常規(guī)配制。

22對硝基苯酚標準曲線的繪制[11]

以1 mol·L-1 碳酸鈉溶液作為溶劑，配成037，594，2375，475，96 mg·L-1對硝基苯酚標準溶液。以1 mol·L-1 碳酸鈉溶液為空白，在紫外可見區(qū)掃描對硝基苯酚的最大吸收峰，最大吸收波長400 nm。以對硝基苯酚質量濃度為橫坐標，最大吸收波長下的吸光度為縱坐標，得出回歸方程y=0026 3x+0076 5（R2=0999 4）。

23β葡萄糖苷酶粗酶活性測定

231粗酶液提取將10 g新鮮玄參洗凈，切成小塊，預冷至4 ℃，于攪拌機中制成勻漿。勻漿試料加入3倍量4 ℃預冷的緩沖液，于4 ℃提取4 h，4 000 r·min-1低溫離心10 min，上清液12 000 r·min-1低溫離心5 min，取上清于4 ℃貯存?zhèn)溆?[1213]。

232酶活性測定5～6 ℃下，在96孔酶標板中依次加入緩沖液20 μL、對硝基苯βD葡萄糖苷（pNPG）12 μL和粗酶提取液12 μL。將酶標板置于培養(yǎng)箱中反應一定時間，向反應體系中加入1 mol·L-1碳酸鈉溶液50 μL終止反應，在400 nm波長下用酶標儀進行紫外吸收檢測。每一個樣品設置5個復孔，取平均值計算酶活性?？瞻讓φ眨杭尤虢K止液之后加入底物，其余操作不變。β葡萄糖苷酶活性國際單位定義為以pNPG為底物， 在一定的分析條件下，每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量[11]。

酶活性（U）=（YV2V）/（KV1Mt）

式中Y為酶促反應的吸光度；V為酶液的提取體積（mL）；V1 為反應體系中酶液體積（mL）；V2為總反應液體積（mL）；K為對硝基苯酚標準曲線的斜率；M為試樣質量（g）；t為反應時間（min）。

24粗酶液提取條件的影響

按照23方法，設計2種提取緩沖液體系檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液與檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液，每種提取液pH分別為40，50，60，確定緩沖液種類之后考察其最適pH 50，55，60，65，70，75，80。反應體系： pH 50緩沖液，25 mmol·L-1 pNPG，37 ℃反應10 min。

25反應條件的影響

按照23方法，用pH 70檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液提取粗酶，不同酶反應環(huán)境下測定酶活力。考察緩沖液pH、底物濃度，反應溫度、反應時間對酶活力的影響。

251反應溶液pH 緩沖液pH分別為25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75。反應體系： 檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液加入25 mmol·L-1pNPG，37 ℃反應10 min。

252反應溫度在30，37，50，60，70 ℃ 5種溫度條件下，反應體系： 檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液加入25 mmol·L-1 pNPG，10 min反應。

253反應時間酶反應經(jīng)5，10，15，20，25，30，35，40 min后，反應體系pH 50緩沖液，25 mmol·L-1pNPG，37 ℃反應。

254pNPG濃度在不同pNPG濃度分為5，10，15，20，25，30 mmol·L-1，反應體系中底物濃度對酶活力。其他反應條件： pH 50緩沖液，50 ℃反應30 min。

26測定條件的優(yōu)化

按照均勻設計法[14]，在單因素實驗結果的基礎上， 根據(jù)均勻設計表U6（64）及其使用表，運用擬水平法設計出以下混合水平的設計表U6（6×32），采用DPS705數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對均勻設計實驗結果按二次多項式逐步回歸方法進行分析。

27不同干燥溫度下酶活性變化

將新鮮玄參去掉首尾部分，余下部分切成4～5小塊，失水情況見圖1，根據(jù)失水情況定時取樣，分別測定干燥溫度40，50，60，70，80，90，100 ℃下，失水率達到10%～100%的酶活性。失水率=（原質量-干燥后質量）/（原質量-干燥恒質量）；恒質量：對5塊試料（1塊215 g±25 g）的干燥前后平均質量差005 g以內。

3結果

31不同緩沖液對酶提取的影響

設計2種提取緩沖液體系，檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液和檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液，可見在此范圍內隨著pH增大，酶活力增大，且檸檬酸磷酸氫二鈉處理的酶活性均明顯高于檸檬酸檸檬酸鈉，故選擇檸檬酸磷酸氫二鈉作為提取緩沖液較為合適。結果見圖2。

32檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液pH對酶提取的影響

可見緩沖液pH對提取β葡萄糖苷酶會產(chǎn)生較大影響。當提取液為pH 70的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液時效果最好， 酶活力達到最大。結果見圖2。

33酶反應環(huán)境對酶活力的影響

331反應溶液pH當反應體系pH 35～60時，測得的玄參中的β葡萄糖苷酶活力高，相對活性90%以上，可見隨著pH升高，酶活力先增大后逐漸降低。

332反應溫度可見50 ℃較其余溫度條件下生成對硝基苯酚量最大。

333反應時間可見30 min時生成對硝基苯酚量最大。

334底物濃度可見pNPG濃度由5 mmol·L-1增加到25 mmol·L-1時酶活力逐漸增大，當達到30 mmol·L-1時，酶活力并未增加，故測定玄參中的β葡萄糖苷酶活力的最適底物濃度為25 mmol·L-1，結果見圖3。

34測定條件的優(yōu)化

341均勻設計采用DPS705數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對均勻設計實驗結果按二次多項式逐步回歸方法進行分析，Y=-10919 763 49+1022 050 935 2X3+0765 483 538 4X1X2-0251 365 022 23X1X3，其中相關系數(shù)r=0998 4，F(xiàn)=20203，P=0004 9，此表均衡性好。實驗設計方案見表1。采用二次多項式逐步回歸得到的方差P<005，有顯著性意義，并得出X1，X2，X3的最佳組合為pH 60，pH 70，20 mmol·L-1。

342驗證按22方法提取粗酶液，選擇pH 70檸檬酸磷酸緩沖液作為粗酶提取液，其他條件不變，再將提取的粗酶液按照23方法測定β葡萄糖苷酶粗酶活性，在pH等于60的反應體系中，加

入濃度為20 mmol·L-1的 pNPG，于50 ℃培養(yǎng)箱中反應30 min，其余條件不變。重復3次酶活性測定結果分別為1267，1256，1273 U，表明優(yōu)化后酶活性達到最大值。

35玄參β葡萄糖苷酶在不同溫度干燥過程中酶活性的變化趨勢

可見干燥溫度50，60 ℃酶活力可高達25 U，其他溫度環(huán)境下低于20 U，在40，50 ℃時，β葡萄糖苷酶活性在整個干燥過程中始終存在，但在60 ℃90%，70 ℃70%，80 ℃70%，90 ℃50%，100 ℃40%時已經(jīng)失去酶活性，結果見表2。并且隨著干燥溫度與失水率的升高、酶活性降低速度呈加快的趨勢，結果見圖4。

4討論

本實驗采用pNPG法測定β葡萄糖苷酶活性，根據(jù)單因素考察及均勻設計實驗優(yōu)化結果確定玄參中β葡萄糖苷酶提取及活性測定的最佳條件。結果表明用pH為70的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液對玄參中β葡萄糖苷酶的提取效果最好，酶活性測定時，選用pH 60的反應體系，pNPG濃度20 mmol·L-1，在50 ℃下反應30 min，所測得酶活性最大。一般觀點認為β葡萄糖苷酶37 ℃條件下酶活力和反應時間有良好的關系，但玄參中的β葡萄糖苷酶在50 ℃30 min反應條件下活性高，與37 ℃條件下反應60 min的吸光度相近，并且反應時間30 min內和酶活性的線性關系較好，y=0025 1x+0439 6，R2=0979 3。因此，結果表明玄參中的β葡萄糖苷酶的最適溫度比較高。

在此基礎上測定了不同干燥條件下，玄參中β葡萄糖苷酶活性的變化情況，新鮮玄參在高溫環(huán)境下，隨著干燥溫度升高以及內部水分的急劇降低，酶活性也快速降低，但40，50 ℃環(huán)境下，即使玄參失水率升高卻依然保持酶活。根據(jù)一般藥材內的水分活性在03～08 Aw時，酶具有活性，推斷玄參在40，50 ℃環(huán)境下，即使干燥至100%，藥材內部的水分活性并沒有隨著水分流失而降至最低點，該結果提示環(huán)境溫度對玄參中β葡萄糖苷酶的活性影響大。

中藥材多數(shù)為干燥品，故干燥方法的差異對質量有較大的影響，目前中藥材玄參的質量穩(wěn)定性本就較難保持，所以必須嚴格控制初加工過程中的質量影響因子。

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[責任編輯孔晶晶]

[收稿日期]20160914

[基金項目]國家科技支撐計劃項目（2011BAI13B022）；重慶市科技研發(fā)基地項目（cstc2014ptyjd10001）；科技富民強縣專項行動計劃項目（國科發(fā)農(nóng)[2014]160號）；重慶市基本科研業(yè)務項目（2015cstcjbky01903）

[通信作者]*李隆云，研究員，主要從事中藥材栽培技術、品種選育與質量評價研究，Tel：（023）89029118，Email： lilongyun8@163com

[作者簡介]喻歡歡，碩士研究生，主要從事天然藥物研究，Email： yuhuanhuan@outlookcom