毛靜月 劉 蕊 李彩云 孟 瑩

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院婦產(chǎn)科,浙江 杭州 310013)

siRNA靶向沉默YAP1對卵巢癌細(xì)胞skov3增殖凋亡的影響

毛靜月 劉 蕊1李彩云 孟 瑩2

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院婦產(chǎn)科,浙江 杭州 310013)

目的 探討小干擾RNA(siRNA)靶向沉默Yes相關(guān)蛋白(YAP)1基因表達(dá)對人卵巢癌細(xì)胞skov3增殖凋亡的影響。方法 采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將靶向干擾YAP1 的siRNA轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期skov3細(xì)胞(siYAP1組)，同時設(shè)不行轉(zhuǎn)染處理的對照組和轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列siRNA的轉(zhuǎn)染對照組(siControl組)，轉(zhuǎn)染48 h后采用實(shí)時定量PCR(qPCR)檢測各組的YAP1 mRNA水平；采用水溶性四氮唑(WST-1)法評價各組轉(zhuǎn)染后的增殖情況，分別采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)及qPCR檢測轉(zhuǎn)染后凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白(抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和促凋亡蛋白Bid、Bax)的mRNA水平，PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果 qPCR法檢測發(fā)現(xiàn)siYAP1組轉(zhuǎn)染48 h后的YAP1 mRNA水平為(0.141±0.018)，低于對照組和siControl組(均P<0.05)，提示在skov3細(xì)胞中靶向沉默YAP1成功；skov3細(xì)胞經(jīng)siRNA靶向沉默YAP1表達(dá)后的生長增殖受明顯抑制、凋亡形態(tài)明顯改變及發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，與對照組和siControl組相比，siYAP1組的增殖抑制率、凋亡率、促凋亡蛋白水平及G0/G1期細(xì)胞比例均升高，而促凋亡蛋白水平及S期細(xì)胞比例均降低(P<0.05)；對照組和siControl組增殖、凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 通過siRNA在基因水平上沉默YAP1表達(dá)可抑制skov3細(xì)胞的增殖并誘發(fā)凋亡和細(xì)胞周期阻滯，在卵巢癌的靶向治療中可能有一定前景。

Yes相關(guān)蛋白1；卵巢癌；增殖；凋亡

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，由于目前缺乏早期篩查手段及發(fā)病較隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，病死率較高，常規(guī)治療手段效果不理想〔1,2〕。近年來發(fā)現(xiàn)Hippo-YAP通路作為一種新抑癌信號通路，在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔3〕。Yes相關(guān)蛋白(YAP)1是Hippo-YAP通路的下游重要效應(yīng)分子，可調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡過程，可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并有望成為靶向治療的一個新靶點(diǎn)〔4,5〕。因此，本研究采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)靶向沉默人卵巢癌細(xì)胞skov3的YAP1表達(dá)，探討在基因水平沉默YAP1基因?qū)kov3細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人卵巢癌細(xì)胞skov3購于上海吉凱基因技術(shù)有限公司，總RNA抽提Trizol購于碧云天生物試劑有限公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購于美國Invitrogen公司，胎牛血清(FBS)、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購于Gibco BRL公司，水溶性四氮唑(WST-1)購于上海寶曼生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于Becton Dickinson公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(ROX)購自Roche公司，靶向干擾YAP1的siRNA(sc-38637)及對照siRNA(YAP1-NC，sc-37007)購自美國Santa Cruz 生物公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 采用含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)skov3細(xì)胞，常規(guī)條件培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時分為3組：(1)對照組，不行轉(zhuǎn)染處理；(2)轉(zhuǎn)染對照組(siControl組)，轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列siRNA；(3)siYAP1組，轉(zhuǎn)染靶向干擾YAP1 的siRNA；采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，當(dāng)每孔細(xì)胞數(shù)約為1.5×105個，siRNA濃度約為40 nmol/L，且LipofectamineTM2000與siRNA比例為1∶1(6孔)時，有較佳的轉(zhuǎn)染效率。

1.3 細(xì)胞增殖活性檢測 取處于增殖期的對照組、siControl組和siYAP1組的skov3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104個/ml并制備成細(xì)胞懸液，以每孔180 μl接種96孔，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72、96 h后加入20 μl WST-1試劑，混勻后繼續(xù)孵育4 h，采用全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光值(A450)并計(jì)算增殖抑制率：抑制率(%)=(對照組A450-siControl組A450或siYAP1組A450)/對照組A450×100%。

1.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率 取處于增殖期的對照組、siControl組和siYAP1組的skov3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/ml，以每孔2 ml接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)條件下培養(yǎng)48、96 h后收集細(xì)胞依次加入5 μl Annexin Ⅴ FITC和5 μl PI后，根據(jù)凋亡檢測試劑盒避光于冰上孵育10 min后，將細(xì)胞重懸后將樣品逐一上機(jī)檢測，每組設(shè)3個復(fù)孔，計(jì)算凋亡率。

1.5 實(shí)時定量PCR(qPCR)檢測YAP1及凋亡相關(guān)蛋白的mRNA水平 收集對照組、siControl組和siYAP1組轉(zhuǎn)染48 h后的skov3細(xì)胞，采用Trizol試劑提取總RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將符合純度和濃度要求的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在羅氏熒光定量PCR Light Cycler 480平臺上，采用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)檢測細(xì)胞中YAP1及凋亡相關(guān)蛋白(抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和促凋亡蛋白Bid、Bax)的mRNA水平，以GAPDH為內(nèi)參。CCAT2上游引物：5'-CTTCGGCTTTATGGCTACCT-3'，下游引物：5'-AAGGTCAGATGGTGGTTGTTC-3';GAPDH上游引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，下游引物:5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3。采用2-△△Ct法計(jì)算細(xì)胞中YAP1、Bcl-2、Mcl-1、Bid和Bax 的相對表達(dá)量。每個樣本設(shè)立三個平行管。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集對照組、siControl組和siYAP1組轉(zhuǎn)染48 h后的skov3細(xì)胞，采用胰蛋白酶消化后，經(jīng)PBS重懸后用乙醇固定30 min，加入100 μg/ml RNase和50 μg/ml PI共1 ml，避光染色30 min，采用美國Beckman公司的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化，采用軟件分別計(jì)算不同周期(G0/G1、S、G2/M)細(xì)胞數(shù)目占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonfferoni檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA靶向沉默skov3細(xì)胞中YAP1的效果分析 以對照組為參考(1.000)，siControl組和SiYAP1組的YAP1 mRNA水平分別為(0.974±0.051)和(0.141±0.018)，SiYAP1組的YAP1 mRNA水平低于對照組和siControl組(均P<0.05)；對照組和siControl組YAP1 mRNA的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細(xì)胞增殖的影響 skov3細(xì)胞經(jīng)siRNA靶向沉默YAP1表達(dá)后的生長增殖受到明顯抑制，在24～96 h的觀察時間內(nèi)siYAP1組的增殖抑制率均高于對照組和siControl組，如與siControl組96 h的增殖抑制率相比，siYAP1組的增殖抑制率升高(72.16±5.21)倍(P<0.05)；對照組和siControl組增殖抑制率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與siControl組比較：2)P<0.05；下表同

2.3 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細(xì)胞凋亡率的影響 skov3細(xì)胞經(jīng)siRNA靶向沉默YAP1表達(dá)后凋亡形態(tài)明顯改變，siYAP1組轉(zhuǎn)染后48、96 h的凋亡率均高于對照組和siControl組(均P<0.05)；對照組和siControl組增殖抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響 skov3細(xì)胞經(jīng)siRNA靶向沉默YAP1表達(dá)后促凋亡基因表達(dá)升高，而抗凋亡基因表達(dá)降低，如siYAP1組轉(zhuǎn)染后48 h的Bcl-2、Mcl-1 mRNA水平均降低，Bid、Bax mRNA水平均升高(均P<0.05)；對照組和siControl組Bcl-2、Mcl-1、Bid和Bax mRNA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 siRNA靶向沉默YAP1對skov3 細(xì)胞凋亡率的影響±s,%)

表3 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響

2.5 siRNA靶向沉默YAP1對skov3細(xì)胞周期的影響 skov3細(xì)胞經(jīng)siRNA靶向沉默YAP1表達(dá)后發(fā)生明顯的G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，如siYAP1組轉(zhuǎn)染后48 h的G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低(均P<0.05)，但G2/M期細(xì)胞比例未發(fā)生明顯變化；對照組和siControl組細(xì)胞周期分布的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 siRNA靶向沉默YAP1對skov3 細(xì)胞周期的影響

3 討 論

Hippo-YAP信號通路中包含多個蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄活性因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡兩者間的平衡，繼而調(diào)控組織再生，由于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，成為目前的研究熱點(diǎn)〔6〕。YAP1作為Hippo-YAP信號通路的下游效應(yīng)分子，受該通路的負(fù)性調(diào)控，主要以磷酸化的形式發(fā)揮作用〔7〕。Hippo-YAP通路為抑癌通路，在惡性腫瘤中常處于失活狀態(tài)，而YAP1可與其下游的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如細(xì)胞周期蛋白E和凋亡調(diào)控因子等，繼而促進(jìn)增殖和抑制凋亡，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔8〕。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抑制YAP1表達(dá)可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的效果。朱世凱等〔9〕的研究發(fā)現(xiàn)在胰腺細(xì)胞PANC-1中采用特異性siRNA靶向沉默YAP1可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡，同時對該細(xì)胞株的體外侵襲能力有顯著的抑制效果。黃惠等〔10〕研究證實(shí)在宮頸癌Hela細(xì)胞中沉默YAP1可顯著抑制抑制該細(xì)胞的增殖及侵襲能力。Zhao等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)在食管癌細(xì)胞EC109 中采用shRNA沉默YAP1可顯著抑制其細(xì)胞增殖和生長。以上研究均提示靶向沉默YAP1可為腫瘤的防治提供新思路，但目前YAP1在卵巢癌中的作用尚不清楚。

本研究采用經(jīng)典的脂質(zhì)體法進(jìn)行靶向YAP1的siRNA轉(zhuǎn)染，qPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后的YAP1 mRNA水平降低，且轉(zhuǎn)染對照序列未發(fā)生明顯變化，表明在skov3細(xì)胞中靶向沉默YAP1成功。腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，伴隨著一系列的變化，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖、細(xì)胞周期、凋亡和侵襲等。本研究結(jié)果顯示靶向沉默YAP1可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。類似的結(jié)果已被廣泛報(bào)道，如Diep等〔12〕發(fā)現(xiàn)YAP1蛋白表達(dá)下調(diào)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，同時細(xì)胞的克隆形成能力減弱；Muramatsu等〔13〕報(bào)道YAP1敲除后可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，且細(xì)胞主要停留在G0/G1期，并誘導(dǎo)P21增加和減少Survivin的轉(zhuǎn)錄。本研究的不足為沒有在體內(nèi)水平研究靶向沉默YAP1對卵巢癌增殖凋亡的影響，下一步將在動物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證本發(fā)現(xiàn)。

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〔2016-05-19修回〕

(編輯 徐 杰)

國家自然科學(xué)基金青年基金(30900659);廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(B2009151)

孟 瑩(1974-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事肺間質(zhì)纖維化、COPD、肺癌等研究。

毛靜月(1975-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0797-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.007

1 火箭軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科 2 廣州南方醫(yī)院呼吸科