周永春 陳云蘭 黃云超

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000)

Sox4在女性肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其機(jī)制

周永春 陳云蘭 黃云超

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000)

目的 探討Sox4在女性肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用及其機(jī)制。方法 76例行肺癌根治術(shù)的女性肺癌組織標(biāo)本為觀察組，49例癌旁肺組織標(biāo)本為對(duì)照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)和Western印跡法檢測(cè)Sox4的表達(dá)水平；采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Sox4表達(dá)，利用脂質(zhì)體2000向肺癌細(xì)胞系XWLC-05轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染XWLC-05為對(duì)照，采用qPCR和Western印跡方法檢測(cè)兩組Sox4表達(dá)水平及內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(EMR)上皮標(biāo)記β-catenin、E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)記Fibronectin、vimentin、N-cadherin的表達(dá)情況，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氯唑溴鹽(MTT)、Transwell及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力。結(jié)果 觀察組Sox4 mRNA水平及蛋白水平表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染組Sox4 mRNA水平及蛋白水平表達(dá)均明顯低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組β-catenin、E-cadherin水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染組Fibronectin、vimentin、N-cadherin水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，Western印跡結(jié)果與qPCR檢測(cè)結(jié)果相一致；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA細(xì)胞后，XWLC-05細(xì)胞增殖能力與未轉(zhuǎn)染組無明顯差異(P>0.05)，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA細(xì)胞后，XWLC-05細(xì)胞侵襲、遷移能力較未轉(zhuǎn)染組明顯降低。結(jié)論 Sox4可能是通過下調(diào)β-catenin、E-cadherin表達(dá)及上調(diào)Fibronectin、vimentin、N-cadherin表達(dá)促進(jìn)EMT發(fā)生，誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。

Sox4；肺癌；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)

目前，由于肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，臨床上仍然缺乏特異性治療性藥物，手術(shù)切除及放化療是臨床常用肺癌治療手段，術(shù)后復(fù)發(fā)及癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致臨床肺癌死亡率急劇升高的主要原因〔1，2〕。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在多種癌癥侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用〔3〕。Sox4是Sox家族重要轉(zhuǎn)錄因子之一〔4〕，研究表明〔5〕，Sox4在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，且受女性激素調(diào)節(jié)，與女性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有潛在關(guān)系，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討Sox4在女性肺癌細(xì)胞EMT中的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年3月至2016年3月我院76例行肺癌根治術(shù)的女性肺癌組織標(biāo)本為觀察組，49例癌旁肺組織標(biāo)本為對(duì)照組，年齡48～72歲，平均(56.34±4.27)歲。肺腺癌52例，鱗癌11例，其他13例；低分化39例，中分化23例，高分化14例；TNM分期Ⅰ期36例，Ⅱ期25例，Ⅲ期15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移37例，標(biāo)本均采用液氮速凍，并保存于-80℃冰箱。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且臨床標(biāo)本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 細(xì)胞系、試劑與儀器 人肺癌細(xì)胞系XWLC-05來自我院外科實(shí)驗(yàn)室。Trizol、DEPC、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScript qPCR Kit(TaKaRa公司，日本)，RT-PCR儀(ABI7700，美國(guó)ABI公司)，紫外分光光度計(jì)(Beckman公司，美國(guó))，脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司，美國(guó))，Sox4小干擾RNA(Sox4-siRNA)試劑盒(Ambion公司，美國(guó))，Sox4、GAPDH引物(生工生物有限公司，上海)，Transwell小室(Corning公司，美國(guó))，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑盒(Sigma公司，美國(guó))。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) Trizol法分別提取肺組織總RNA，所提RNA經(jīng)OD測(cè)定，OD260 nm/OD280 nm比值1.8～2.0，提示所提RNA為高純度RNA，無蛋白質(zhì)、DNA殘留。28 s和18 s亮度比值基本符合2∶1，說明RNA完整性好，無降解。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)qPCR所用引物由上海生工合成，Sox4，正向CTTGACATGATTAGCTGGCATGATT；反向CCTGTGCAATATGCCGTGTAGA。GAPDH，正向CCAAAATCAGATGGGGCAATGCTGG；反向TGATGGCATGGAC-TGTGGTCATTCA。反應(yīng)總體積10 μl：cDNA 1 μl，SYBR Primix Ex Taq TM 5 μl，引物0.4 μl，RNase H2O 10 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，70℃ 30 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果采用2-ΔΔCT方法處理，其中ΔΔCT=(CTSox4-CTGAPDH)觀察組-(CTSox4-CTGAPDH)對(duì)照組。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法 采用Western印跡方法檢測(cè)Sox4蛋白水平表達(dá)量，提取細(xì)胞總蛋白及蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Sox4表達(dá)，利用脂質(zhì)體2000向肺癌細(xì)胞系XWLC-05轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染XWLC-05為對(duì)照，XWLC-05細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，取1×105/ml個(gè)肝癌細(xì)胞接種于制備好的平板上，過夜培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)40%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。操作嚴(yán)格按照試劑操作說明書。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn) 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后XWLC-05肺癌細(xì)胞增殖能力，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書，采用酶聯(lián)免疫分析儀，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定樣本吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染XWLC-05細(xì)胞培養(yǎng)48 h后消化并計(jì)數(shù)，取2×105/ml細(xì)胞置于已滅菌1.5 ml Eppendorf管中，滴加200 μl空白培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照Transwell小室試劑盒說明嚴(yán)格操作(侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell小室需鋪Matrigel膠，遷移實(shí)驗(yàn)則不需要)，固定染色后，200倍顯微鏡下，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 觀察組與對(duì)照組中Sox 4表達(dá)水平比較 觀察組Sox4 mRNA水平(2.64±0.32)明顯高于對(duì)照組(1.31±0.16，P<0.05)，Western印跡結(jié)果亦相同。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染后XWLC-05細(xì)胞中Sox4表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染組Sox4 mRNA水平(0.19±0.03)明顯低于未轉(zhuǎn)染組(1.37±0.14)(P<0.05)，Western印跡結(jié)果亦一致。見圖2。

圖1 兩組Sox4相對(duì)表達(dá)情況

圖2 轉(zhuǎn)染后Sox4表達(dá)情況

2.3 Sox4誘導(dǎo)XWLC-05細(xì)胞發(fā)生EMT 見圖3。轉(zhuǎn)染組β-catenin、E-cadherin水平(2.06±0.22、1.56±0.17)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(0.53±0.08、0.42±0.06，P<0.05)，轉(zhuǎn)染組Fibronectin(1.13±0.10)、vimentin(1.34±0.09)、N-cadherin水平(1.08±0.07)明顯低于未轉(zhuǎn)染組(4.26±0.30、2.58±0.27、3.72±0.24，P<0.05)，Western印跡結(jié)果亦一致。

圖3 兩組EMT相關(guān)基因在XWLC-05細(xì)胞中表達(dá)情況

2.4 Sox4表達(dá)水平對(duì)XWLC-05細(xì)胞增殖能力影響 轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA細(xì)胞后，XWLC-05細(xì)胞增殖能力與未轉(zhuǎn)染組無明顯差異(P>0.05)。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA細(xì)胞后XWLC-05細(xì)胞增殖情況

2.5 Sox4表達(dá)水平對(duì)XWLC-05細(xì)胞侵襲、遷移能力影響 轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA后，轉(zhuǎn)染組XWLC-05細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)〔(92.03±11.56)個(gè)〕明顯少于未轉(zhuǎn)染組〔(343.71±29.46)個(gè)〕，轉(zhuǎn)染組XWLC-05細(xì)胞遷移距離〔(58.37±5.28)nin〕明顯短于未轉(zhuǎn)染組〔(90.65±9.47)nin〕(均P<0.05)。見圖5，圖6。

圖5 轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA后XWLC-05細(xì)胞侵襲情況(×200)

圖6 轉(zhuǎn)染Sox4-siRNA后XWLC-05細(xì)胞遷移情況(×100)

3 討 論

控?zé)熯\(yùn)動(dòng)的開展使男性肺癌發(fā)病率及死亡率有所下降，但女性肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)〔6〕。手術(shù)是治療肺癌的首選方法，但大多數(shù)肺癌患者往往因肺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移而喪失手術(shù)治療機(jī)會(huì)，此時(shí)臨床常選擇放化療進(jìn)行治療。放化療在取得良好療效的同時(shí)，也給病人帶來了極大的痛苦及不良反應(yīng)〔7〕。因此，尋找及開發(fā)高效、特異的治療靶點(diǎn)對(duì)于臨床治療肺癌意義重大〔8,9〕。EMT是上皮細(xì)胞通過特定的細(xì)胞程序轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)過程，通過高度保守的程序使上皮細(xì)胞失去諸如細(xì)胞極性、細(xì)胞黏附及下調(diào)β-catenin、E-cadherin上皮細(xì)胞標(biāo)記物，從而獲得遷移、侵襲、抗凋亡能力、細(xì)胞骨架重組及上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物Fibronectin、vimentin、N-cadherin等間充質(zhì)細(xì)胞特性〔10〕。大量研究證實(shí)〔11〕，EMT能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。Sox4屬于SOX家族C亞族基因，定位于人類Y染色體上6p22.3，在基因調(diào)控中起轉(zhuǎn)錄因子作用〔12〕，多項(xiàng)研究表明，Sox4在乳腺癌〔13〕、肺癌〔14〕、結(jié)腸癌〔15〕等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，Sox4可能是惡性腫瘤的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

本研究提示Sox4參與肺癌發(fā)生發(fā)展；Sox4-siRNA轉(zhuǎn)染肺癌XWLC-05細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。EMT相關(guān)基因?qū)崟r(shí)qPCR檢測(cè)結(jié)果提示Sox4誘導(dǎo)肺癌XWLC-05細(xì)胞發(fā)生EMT過程，且下調(diào)Sox4可明顯抑制EMT過程發(fā)生；通過MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，Transwell細(xì)胞侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證下調(diào)Sox4對(duì)EMT過程調(diào)節(jié)所導(dǎo)致XWLC-05細(xì)胞增殖、侵襲、遷移變化，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示下調(diào)Sox4對(duì)XWLC-05細(xì)胞增殖無明顯影響；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示下調(diào)Sox4可使XWLC-05細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯降低，即抑制Sox4表達(dá)可降低肺癌細(xì)胞的侵襲及遷移。

綜上，Sox4可能是通過下調(diào)β-catenin、E-cadherin表達(dá)及上調(diào)Fibronectin、vimentin、N-cadherin表達(dá)促進(jìn)EMT發(fā)生，誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。

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〔2016-03-13修回〕

(編輯 苑云杰)

The function and mechanism of Sox4 in the epithelial mesenchymaltransition of human lung cancer cells

ZHOU Yong-Chun,CHEN Yun-Lan,HUANG Yun-Chao.

The Third Affiliated Hospital,Kunming Medical University,Kunming 650000,Yunnan,China

Objective To investigate the function and mechanism of Sox4 in the epithelial mesenchy maltransition of human lung cancer cells.Methods 76 cases of female lung cancer tissue were selected as observation group,and 49 cases of cancerous lung tissue as control group. The expression level of two groups were observed by real time-qPCR and Western blot. RNA interference technology was used to detect down-regulation of expression of Sox4 by liposome to 2000 female lung cancer cell line XWLC-05 transfected with Sox4-siRNA,and the non transfected XWLC-05 as the control,qPCR and Western blot method were used to detect the expression level of Sox4 in two groups,and the epithelial marker EMR β-catenin,E-cadherin,expression of mesenchymal markers Fibronectin,vimentin,N-cadherin. The proliferation,invasion and migration ability of the transfected and non transfected cells were detected by MTT,Transwell and cell scratch test. Results Sox4 and protein levels of mRNA expression of observation group were significantly higher than those of control group (P<0.05);Sox4 mRNA and protein levels of expression of transfection group were significantly lower than those of non transfection group (P<0.05);qPCR results showed that P-catenin,E-cadherin levels of transfection group were significantly higher than those without transfection group (P<0.05).N-cadherin levels of fibronectin,vimentin,transfection group were significantly lower than those of non transfection group (P<0.05),Western blot and qPCR detection results were consistent;the results of MTT showed that the transfected Sox4-siRNA cell,XWLC-05 cell proliferation was not significantly different from that of non transfection group (P>0.05) Transwell,the experimental results showed that after transfection into Sox4-siRNA cells,XWLC-05 cell invasion and migration ability was significantly lower in non transfection group. Conclusions Sox4 may be through downregulation of beta E-cadherin,β-catenin expression and up regulation of Fibronectin,vimentin,N-cadherin expression to promote the occurrence of epithelial mesenchymal transition,induce the invasion and metastasis of human lung cancer cells.

Sox4;Lung cancer;Epithelial mesenchymal transition

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金(No.81460441)；云南省教育廳科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2013Z110)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金項(xiàng)目(No.2013FB132)

黃云超(1962-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事肺癌研究。

周永春(1976-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事肺癌研究。

R735

A

1005-9202(2017)04-0794-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.006