王慶元 吳向軍 張曉燕 崔家玉

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬濱州市人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濱州 256600)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植對兔腹主動脈成形術(shù)后再狹窄和平滑肌細(xì)胞增殖的影響

王慶元 吳向軍 張曉燕 崔家玉

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬濱州市人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濱州 256600)

目的 探討兔腹主動脈血管成形術(shù)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對兔腹主動脈再狹窄和平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法 將60只新西蘭大白兔隨機(jī)分為對照組、損傷組、移植組各20只。所有動物均穿刺股動脈，對照組不進(jìn)行球囊擴(kuò)張損傷腹主動脈，損傷組和移植組送入球囊擴(kuò)張損傷腹主動脈，損傷組注射等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，移植組用經(jīng)4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)熒光標(biāo)記的BMSCs以1×107/kg的細(xì)胞數(shù)經(jīng)血管注射到損傷血管的局部。術(shù)后4 w取腹主動脈行免疫組織化學(xué)染色檢測平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在血管內(nèi)膜上的表達(dá)情況，測定PCNA陽性細(xì)胞核數(shù)量，計算PCNA增殖指數(shù)。HE染色行血管形態(tài)計量分析包括內(nèi)膜中膜厚度、內(nèi)膜中膜面積，衡量血管狹窄情況。結(jié)果 損傷組新生血管內(nèi)膜層α-SM-actin表達(dá)明顯強(qiáng)于對照組(P<0.05)，移植組新生血管內(nèi)膜α-SM-actin表達(dá)，與損傷組比較明顯增強(qiáng)(P<0.05)。對照組血管內(nèi)膜無PCNA陽性表達(dá)，損傷組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多(P<0.05)。移植組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較損傷組明顯減少(P<0.05)。損傷組腹主動脈明顯狹窄，內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜面積、中膜厚度、中膜面積、血管狹窄程度等指標(biāo)明顯高于移植組和對照組(P<0.05)，移植組腹主動脈有所狹窄，但血管形態(tài)學(xué)指標(biāo)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 兔腹主動脈球囊損傷后導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖及動脈管腔狹窄。BMSCs血管局部移植可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，減輕動動脈粥樣硬化及狹窄程度。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腹主動脈；平滑肌細(xì)胞；增殖；再狹窄

血管再狹窄是冠狀動脈介入治療的主要和嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究表明，血管內(nèi)膜損傷后，平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌是再狹窄發(fā)生的主要機(jī)制〔1〕。另外，炎性細(xì)胞的浸潤造成血管的炎癥反應(yīng)，使血管內(nèi)皮損傷、血管僵硬度增加、血管平滑肌細(xì)胞增殖在血管再狹窄過程中也起了十分重要的作用〔2〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有多項分化潛能，可向內(nèi)皮細(xì)胞分化，參與損傷血管內(nèi)膜的修復(fù)，在抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，減輕再狹窄過程中可能起到一定作用，但具體機(jī)制不明。本研究通過血管局部移植BMSCs，探討對兔腹主動脈再狹窄和平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 健康8～12月齡新西蘭大白兔60只，雌雄不拘，體重2.5～3.50 kg，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。小鼠抗兔平滑肌肌動蛋白(2-Sm-actin)抗體購自美國Neomarker公司，小鼠抗兔增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)購自美國Zymed公司，小鼠抗兔CD34、CD90抗體購自中杉金橋公司，4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)購自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，雙目光學(xué)顯微鏡、石蠟切片機(jī)(LX-75)及計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)來自德國Leica公司。

1.2 動物分組損傷模型的建立 實驗動物隨機(jī)分為對照組、損傷組、移植組，每組20只。動物術(shù)前8 h禁食，不禁水，稱體重量。常規(guī)建立耳緣靜脈輸液通路，以3%戊巴比妥1 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉實驗動物，麻醉后動物背位固定于手術(shù)臺，雙側(cè)腹股溝區(qū)用10%硫化鈉脫毛。常規(guī)消毒鋪巾后，Seldinger技術(shù)穿刺股動脈并留置鞘管，經(jīng)鞘管注入普通肝素200 U抗凝，沿鞘管送入球囊導(dǎo)管至主動脈弓處，肝素生理鹽水充盈球囊10～12 atm(1 atm =760 mmHg)，后自近心端緩慢回拉球囊，同時降低球囊內(nèi)壓力，保持球囊回撤維持一定阻力，上述過程持續(xù)約1 min，每次球囊擴(kuò)張持續(xù)時間約30 s，間隔20 s后回縮球囊后再次送入球囊導(dǎo)管，反復(fù)3次，撤出球囊導(dǎo)管，同時拔除動脈鞘管，壓迫止血15～20 min后，繃帶加壓包扎固定，4～6 h后解除繃帶包扎。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定、標(biāo)記和移植 在無菌條件下通過骨髓穿刺兔股骨抽取骨髓液，將采集到的骨髓液離心后用10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，原代培養(yǎng)3 d后開始更換培養(yǎng)液，BMSCs增殖到90%時傳代，第3代BMSCs備用。取第3代BMSCs與用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD34、CD90抗體在37℃的培養(yǎng)箱中孵育30 min，用1%的多聚甲醛固定，行流式細(xì)胞儀檢測。移植前將DAPI加入細(xì)胞懸液中，同樣在37℃的培養(yǎng)箱中孵育30 min，將培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，放入PBS沖洗瓶中去除細(xì)胞表面非特異結(jié)合的DAPI。移植組從球囊導(dǎo)管交換導(dǎo)絲側(cè)孔按1×107/kg的細(xì)胞數(shù)將標(biāo)記好的BMSCs注入損傷血管處，同時抽取1 ml生理鹽水將導(dǎo)管內(nèi)的BMSCs沖入兔主動脈內(nèi)，保留30 min后撤出球囊，損傷組注入等量的PBS液，對照組只進(jìn)行股動脈穿刺和留置鞘管，不進(jìn)行球囊損傷。

1.4 移植的BMSCs向血管內(nèi)膜歸巢的檢測 術(shù)后1 w取材，熒光顯微鏡下觀察到血管內(nèi)膜上有DAPI標(biāo)記的BMSCs即為歸巢的BMSCs。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測和組織形態(tài)學(xué)分析 術(shù)后4 w取材血管組織，行α-SM-actin和PCNA免疫組織化學(xué)染色。在石蠟切片血管環(huán)上，首先滴加小鼠抗兔PCNA，α-SM-actin(1∶200倍稀釋)，陰性對照滴加PBS緩沖液，4℃孵育過夜，再用山羊抗兔37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，觀察各組血管內(nèi)膜PCNA，α-SM-actin表達(dá)情況。對石蠟切片進(jìn)行HE染色，用計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)測量內(nèi)膜厚度(IT)、內(nèi)膜面積(IA)、中膜厚度(MT)、中膜面積(MA)，計算血管狹窄程度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗及t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)、鑒定及歸巢 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示BMSCs CD90的表達(dá)率為96.73%，CD34為0.21%。術(shù)后1 w，熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光的BMSCs 歸巢到受損傷的血管內(nèi)膜處(圖1)。

圖1 BMSCs的歸巢

2.2 各組主動脈HE染色觀察結(jié)果 對照組血管壁厚度均一，腔面有單層內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞呈紫藍(lán)色；血管內(nèi)膜光滑，未見平滑肌細(xì)胞，中膜平滑肌細(xì)胞呈梭型，管腔無明顯狹窄。損傷組顯微鏡下于損傷處內(nèi)膜可見大量平滑肌細(xì)胞增生，排列方向亂而不規(guī)則，增生內(nèi)膜厚度極不均勻，腔面不規(guī)整，中膜明顯變厚，管腔明顯狹窄。移植組顯微鏡下亦可見新生內(nèi)膜形成，內(nèi)膜和中膜變厚，中膜可見平滑肌細(xì)胞增生，管腔亦變狹窄，平滑肌細(xì)胞有中膜遷移至內(nèi)膜下，但平滑肌細(xì)胞增生及血管狹窄程度均明顯輕于損傷組。見圖2。

2.3 各組α-SM-actin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 光鏡下觀察對照組血管內(nèi)膜則無α-SM-actin陽性表達(dá)，血管中膜可見α-SM-actin陽性表達(dá)增強(qiáng)，染色呈棕黃色。損傷組新生血管內(nèi)膜層有α-SM-actin陽性強(qiáng)表達(dá)，明顯強(qiáng)于對照組〔(0.189±0.035)vs(0.011±0.003),P<0.05〕。移植組新生血管內(nèi)膜中可見α-SM-actin陽性表達(dá)，與損傷組比較明顯增強(qiáng)〔(0.451±0.035)vs(0.189±0.035),P<0.05〕。見圖3。

2.4 各組間PCNA免疫組織化學(xué)染色及陽性細(xì)胞數(shù)比較 光鏡下觀察對照組血管內(nèi)膜無PCNA陽性表達(dá)，損傷組新生血管內(nèi)膜中可見PCNA陽性強(qiáng)表達(dá)，并向管腔面聚集，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多〔(21.40±3.75)個 vs(6.25±1.35)個,P<0.05〕。移植組血管內(nèi)膜亦可見PCNA陽性表達(dá)，但PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較損傷組明顯減少〔(11.32±3.15)個 vs(21.40±3.75)個,P<0.05〕。見圖4。

2.5 各組兔4 w后內(nèi)膜中膜厚度面積及狹窄程度比較 見表1。損傷組IT、MT、IA、MA及狹窄程度均明顯高于對照組和移植組(均P<0.05)，移植組上述指標(biāo)高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

圖2 各組兔腹主動脈染色結(jié)果(HE，×200)

圖3 各組兔腹主動脈α-SM-actin免疫組織 化學(xué)染色結(jié)果(DAB，×400)

圖4 各組兔腹主動脈PCNA免疫組織化學(xué) 染色結(jié)果(DAB，×400)

指標(biāo)對照組損傷組移植組IT(mm)0.48±0.061.59±0.311)2)0.59±0.09MT(mm)1.56±0.172.38±0.521)2)1.79±0.27IA(mm2)1.01±0.134.39±1.131)2)1.23±0.46MA(mm2)2.75±0.776.74±1.461)2)3.12±1.17IT/MT(%)41.05±7.7772.35±9.771)2)47.13±6.81IA/MA(%)39.95±5.9975.08±7.261)2)43.14±5.33狹窄(%)21.05±8.5482.08±11.841)2)30.35±10.37

與對照組比較：1)P<0.05；與移植組比較：2)P<0.05

3 討 論

血管損傷后的血管內(nèi)膜的異常增生在血管再狹窄過程中起了重要的作用，如在動脈粥樣硬化及再狹窄的過程中，血管平滑肌的遷移、異常增殖和大量細(xì)胞外基質(zhì)的分泌是起重要環(huán)節(jié)。因此，修復(fù)內(nèi)膜，有效抑制血管平滑肌的增殖可減輕血管內(nèi)狹窄的程度。

BMSCs 主要來源于胚胎時期的中胚層，不僅易于體外擴(kuò)增，還具有多種分化能力，在誘導(dǎo)劑的體外誘導(dǎo)下，BMSCs 可向內(nèi)皮細(xì)胞分化，修復(fù)受損傷的內(nèi)膜〔3〕。在BMSCs 與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗中發(fā)現(xiàn)〔4〕，平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖能力明顯下降，說明BMSCs在一定程度上抑制了平滑肌細(xì)胞的增殖。Wu等〔5〕建立大鼠心肌梗死模型，將BMSCs 注射到大鼠梗死相關(guān)血管內(nèi)，2 w后病理組織學(xué)研究顯示，梗死血管的血栓負(fù)荷明顯減輕，血管出現(xiàn)再通趨勢，同時冠狀動脈的狹窄程度有所減輕。劉志江等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷兔頸總動脈后移植BMSCs 于血管損傷處，4 w后行勁總動脈血管造影顯示，移植組血管狹窄程度較對照組明顯減輕，由此得出BMSCs移植減輕血管再狹窄的結(jié)論。Foteinos等〔7〕將BMSCs移植到ApoE基因敲除的小鼠的動脈粥樣硬化區(qū)域，發(fā)現(xiàn)BMSCs減輕了了動脈粥樣硬化的程度，延緩了狹窄的發(fā)生。本研究在兔腹主動脈損傷后行BMSCs移植發(fā)現(xiàn)移植組可見細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光的BMSCs 歸巢到血管損傷內(nèi)膜處，而損傷組和對照組均無上述現(xiàn)象，說明BMSCs具有向損傷的血管內(nèi)膜歸巢的能力。經(jīng)BMSCs移植能抑制損傷血管內(nèi)膜的異常增生，減輕血管損傷后再狹窄。

當(dāng)動脈損傷時，內(nèi)膜細(xì)胞增生，管腔喪失代償性擴(kuò)張能力，成為血管再狹窄的一個重要原因。Shi等〔8〕的研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)增加是導(dǎo)致?lián)p傷血管內(nèi)膜瘢痕形成、彈性回縮的重要因素，平滑肌細(xì)胞由正常的收縮表型轉(zhuǎn)化成增殖能力異常提高的合成表型，因此，有效抑制上述過程有助于減輕再狹窄的發(fā)生。

研究證實〔9〕，球囊損傷動脈后早期，血管內(nèi)膜上出現(xiàn)的平滑肌細(xì)胞異常增殖，成合成表型，免疫組織化學(xué)顯示α肌動蛋白(α-actin)表達(dá)減弱。在我們的實驗中，光鏡下觀察到移植組新生血管內(nèi)膜中可見α-SM-actin陽性表達(dá)，與損傷組比較明顯增強(qiáng)。這是由于球囊損傷后，血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化，大多數(shù)處于合成表型，增值能力明顯提高，而BMSCs移植后，損傷血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞由收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)化能力下降，合成型平滑肌細(xì)胞明顯減少，平滑肌細(xì)胞異常增值能力受到抑制，血管再狹窄的程度較損傷組明顯減輕。

PCNA是一種核蛋白，其相對分子質(zhì)量為36 000，PCNA在平滑肌細(xì)胞增殖過程中合成活躍〔10,11〕，表達(dá)呈周期依賴性，其表達(dá)能力在G1開始增加，高峰出現(xiàn)在S期，G2、M期開始下降。PCNA是評價平滑肌細(xì)胞增殖狀態(tài)的可靠指標(biāo)，其表達(dá)水平與平滑肌細(xì)胞的增殖活躍程度成正比。本研究結(jié)果顯示，BMSCs移植抑制了平滑肌細(xì)胞的增殖，從而減輕動脈再狹窄進(jìn)程。

綜上所述，兔腹主動脈損傷后局部移植BMSCs，能歸巢到受損傷的血管內(nèi)膜處，促進(jìn)了血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞向收縮表型的轉(zhuǎn)化，抑制了平滑肌細(xì)胞的過度增殖，減輕了血管再狹窄，為動脈粥樣硬化及狹窄的防治提供新的途徑。

1 DeSantiago J，Bare DJ，Semennov I，etal.Excitation-contraction coupling in ventricular myocytes is enhanced by paracrine signaling from mesenchymal stem cells〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2012；52(6)：249-56.

2 Watson T，Goon PK，Lip GY.Endothelial progenitor cells，endothelial dysfunc-tion，inflammation and oxidative stress in hypertension〔J〕.Antioxid Redox Signal，2008；10(8)：1079-88.

3 Pankajakshan D，Kansal V，Agrawal DK.In vitro differentiation of bone marrow derived porcine mesenchymal stem cells to endothelial cells〔J〕.Tissue Eng Regen Med，2012；10(7)：478-83.

4 李 賀，周 欣，舒 瑤，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對心肌缺血/再灌注大鼠心肌膠原與血管新生的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2008；16(4)：813-8.

5 Wu X，Wang C，Tang C，etal.Mesenchymal stem cell seeding promotes reendothelialization of the endovascular stent〔J〕.J Biomed Mater Res A,2011；98(3)：442-9.

6 劉志江，石 蓓，許官學(xué)，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對兔頸動脈損傷后再狹窄的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2013；21(1)：22-7.

7 Foteinos G，Hu Y，Xiao Q，etal.Rapid endothelial turnover in atherosclerosis-prone areas coincides with stem cell repair in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Circulation，2014；17(14)：1856-63.

8 Shi Y，OJ Jr,Mannion JD，etal.Remodeling of autologous saphenous vein grafts.The role of perivascular myofibroblasts〔J〕.Circulation，2011；95(12)：268-9.

9 Hong MK，Mintz GS，Abizaid AS，etal.Intravascular ultrasound assessment of the presence of vascular remodeling in diseased human saphenous vein by passgrafts〔J〕.Am J Cardiol，2009；84(9)：992-8.

10 Branca M，Ciotti M，Giorgi C，etal.Up-regulation of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)is closely associated with high-risk human papillomavirus(HPV) and progression of cervical intraepithelial neoplasia(CINI but does not predict disease outcome in cervical cancer)〔J〕.Eur J Obstetrics Gyneco Reprod Biol，2007；130(2)：223-31.

11 Zhang DZ，Zhang TL，Hu CM，etal.PTEN gene transfaction on rabbit inhibition of restenosis experimental research〔J〕.Chin Health Nutr，2012；7(12)：1-2.

〔2015-09-07修回〕

(編輯 曹夢園)

吳向軍(1977-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事心臟介入研究。

王慶元(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管病學(xué)診斷與治療研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)04-0814-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.013