黨 輝 牟宗玲 宋 銳 王 濤 關(guān)徐濤 高 萍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

藤梨根提取物對人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖抑制的影響

黨 輝 牟宗玲1宋 銳1王 濤 關(guān)徐濤 高 萍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

目的 研究藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞SGC7901的抑制作用及其機制。方法 用MTT法檢測不同劑量的藤梨根提取物對人胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖抑制作用，并用流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞周期以及凋亡程度。結(jié)果 在濃度范圍25～200 μg/ml范圍內(nèi)，不同濃度的藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞SGC7901均有抑制作用，且有一定的濃度依賴性。且在藤梨根提取物細(xì)胞濃度為53、86以及142 μg/ml作用48 h后SGC7901在S期比例增多，凋亡率明顯增加。結(jié)論 藤梨根提取物可能通過干預(yù)細(xì)胞周期和凋亡對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖起抑制作用，同時與藥物濃度有一定的依賴性。

藤梨根提取物；胃癌細(xì)胞SGC7901；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期

胃癌是目前較常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，治療仍以手術(shù)和化療為主〔1〕。中醫(yī)學(xué)對于胃癌的認(rèn)識主要見于“噎膈”、“反胃”、“胃脘痛”、“癮積”等病的描述中。中藥可減輕患者放化療的不良反應(yīng)，降低術(shù)后的高復(fù)發(fā)率，同時能夠改善患者的生存質(zhì)量，延長患者的生存期。本課題組前期研究成果發(fā)現(xiàn)，藤梨根對胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤均有較好的療效。本文擬觀察藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖抑制情況。

1 材料與方法

1.1 藥物 將購于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房的藤梨根1 kg陰干粉碎備用。取500 g藤梨根加入2 000 ml正丁醇浸泡24 h，加熱、回流、過濾后藥渣再進行一次提取。將兩次所得的提取物合并，給予減壓回收至膏狀，干燥后研末取20 mg以備用。

1.2 SGC7901細(xì)胞株 由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供。采用濃度為100 ml/L胎牛血清的RPMI1640作為培養(yǎng)基，在溫度為37℃且5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培育。每隔1 d換液，SGC7901細(xì)胞每3 d傳代一次，傳代時用濃度為2.5 g/L胰酶溶液進行消化，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.3 試劑與儀器 MTT(Amresco sangon公司)、細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640(美國Invitrogen公司)、0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)、凋亡試劑盒及周期試劑盒(南京凱基生物公司)、流式細(xì)胞儀(美國Bectondickinson公司)、紫外分光光度儀(日本Hitachi,U-2001)、比色儀(芬蘭KHB公司)、電子分析天平(Bosch AE 200)等。

1.4 方法

1.4.1 MTT法檢測藤梨根提取物對SGC7901的抑制率 將20 mg藤梨根提取物溶解于1 ml二甲基亞砜(DMSO)，備用時稀釋。SGC7901接種于96孔板內(nèi)，每孔內(nèi)104個細(xì)胞/100 ml培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)液并加入濃度為25、50、100、200、400 μg/ml的藤梨根提取物100 μl。另設(shè)對照孔，對照孔中加入培養(yǎng)液100 μl和稀釋藥物等量的DMSO。每組設(shè)有八個復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后加入5 mg/ml MTT 15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后將上清液吸去，另每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min后比色，顯微鏡下觀察結(jié)晶完全溶解，選擇570 nm于酶標(biāo)儀上測定吸光度(OD值)，實驗分別重復(fù)3次。記錄結(jié)果計算各濃度藤梨根提取物對細(xì)胞的抑制率(IR)，計算公式：抑制率(%)=(對照孔OD值-用藥孔OD值)/對照孔OD值×100%

1.4.2 流式細(xì)胞檢測 SGC7901細(xì)胞按密度為105/ml接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)后加入含有不同濃度藤梨根提取物的RPMI1640培養(yǎng)液，對照組加入RPMI1640培養(yǎng)液以及溶解藥物等量的DMSO，培養(yǎng)48 h后回收細(xì)胞。將等待進行細(xì)胞周期檢測的藥物進一步處理：將細(xì)胞進行常規(guī)消化收集，4℃ PBS懸浮細(xì)胞，復(fù)加入濃度為70%、20℃的乙醇溶液固定24 h后加入RNAase，在37℃水浴加熱30 min，加入碘化丙啶進行熒光染色，200目過濾細(xì)胞至流式管內(nèi)。將進行細(xì)胞凋亡實驗的細(xì)胞進行如下處理：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶進行消化并收集細(xì)胞。同樣用4℃ PBS洗滌后進行離心收集，加入Annexin V-FITC，避光10 min加入PI后再次避光5 min并于1 h后上機檢測，重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件，實驗數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析的兩兩比較法，IC50計算采用線性回歸。

2 結(jié) 果

2.1 藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖的抑制作用 不同濃度的藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞SGC7901均有著不同程度的體外抑制作用，同時也表現(xiàn)為一定程度的劑量依賴性(P<0.05)。應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)處理藤梨根提取物的濃度與抑制率之間的線性回歸關(guān)系，回歸分析法得R2=0.966 088，Y=0.003 477x+0.032 16，根據(jù)公式最后所得IC50=142.17 μg/ml，見表1。

表1 藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞 SGC7901增殖抑制作用

與空白對照組相比：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 藤梨根提取物對SGC7901細(xì)胞周期的影響 根據(jù)公式得IC50=142.17 μg/ml、IC30=86 μg/ml、IC15=53 μg/ml。將此三種濃度分別作為高、中、低三組作用于SGC7901細(xì)胞。作用48 h后，三組與對照組相比均表現(xiàn)為G1期減少，S期增加(P<0.01)，見表2。

表2 藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞SGC7901 細(xì)胞周期的影響

與空白對照組比較：1)P<0.01

2.3 藤梨根提取物對胃癌細(xì)胞SGC7901誘導(dǎo)凋亡的作用 與細(xì)胞周期一樣，分別應(yīng)用高、中、低三種不同濃度藤梨根提取物作用胃癌SGC7901細(xì)胞48 h，與對照組〔(4.68±0.54)%〕相比凋亡率〔高、中、低濃度組分別為(11.22±1.57)%、(10.05±1.56)%、(7.70±0.48)%〕明顯增加(P<0.01)。

3 討 論

近年來，臨床中充分顯示了中醫(yī)藥配合化療治療胃癌療效顯著，國內(nèi)眾多醫(yī)家不懈努力，已經(jīng)探索出許多中醫(yī)藥治療胃癌的有效方法，通過辨證論治和辨病專方治療以及中西醫(yī)結(jié)合治療緩解臨床癥狀，改善患者生存質(zhì)量，延長了生存期，彰顯了中醫(yī)藥特色，中西醫(yī)結(jié)合個體化治療將是一個必然的發(fā)展方向。藤梨根是獼猴桃科軟棗獼猴桃的根部，藤梨根甘、寒、澀。《河北中草藥》記載藤梨根：“能清利濕熱，利膽退黃同時能夠通乳，可以治療消化不良、乳汁不下、濕熱黃疸，也能治療跌打損傷以及風(fēng)濕痹癥，擅于治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤”?！肚鄭u中草藥》記載：“本品性平，味甘、微酸，能入腎經(jīng)以及陽明經(jīng)，具有清熱解毒、除濕通絡(luò)的功效?！蓖跣憔辍?〕以MTT法測得藤梨根單體作為食管癌耐藥逆轉(zhuǎn)劑以及通過下調(diào)polβ的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)藤梨根提取物對食管癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.66 μg/ml。崔學(xué)梯〔3〕用RAE作用于Ec9706/cDDP后，使Ec9706/cDDP細(xì)胞對DDP耐藥性起到了部分逆轉(zhuǎn)作用，逆轉(zhuǎn)機制主要是與 GST-π基因的表達(dá)水平有關(guān)。有關(guān)藤梨根提取物中抗腫瘤作用的主要成分，由于實驗方法不一，所得到的有效成分也不盡相同，曾有人報道主要為三萜類化合物、熊果酸以及多種氨基酸或糖類等〔4〕。目前查閱文獻(xiàn)對于藤梨根的提取主要有正丁醇和乙酸乙酯兩種方法，但哪種提取方法能夠有效地將藤梨根的有效成分提取至今鮮有報道。本實驗考慮到制備方法等問題選用藤梨根正丁醇提取物，而且主要含三帖類化合物，可以用于胃癌細(xì)胞的體外實驗研究。

細(xì)胞凋亡是各種生物最重要的一種生命現(xiàn)象。對于細(xì)胞凋亡的抑制以及凋亡基因的紊亂是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，而細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后均有密切關(guān)系。所以在腫瘤的治療上應(yīng)當(dāng)盡可能誘導(dǎo)其凋亡。本實驗結(jié)果顯示不同濃度的藤梨根提取物對胃癌SGC7901細(xì)胞均能有不同程度的抑制作用，同時表現(xiàn)為一定的劑量依賴性，藥物濃度越大，抑制率越高。

本研究為了進一步證實藤梨根抑制胃癌細(xì)胞的增殖，通過流式細(xì)胞技術(shù)觀察了SGC7901的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示藤梨根提取物能顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期將其阻滯在S期，同時也表現(xiàn)為一定程度的劑量依賴性。故后期我課題組將觀察大劑量藤梨根提取物是否有副作用。由于藤梨根具有清熱解毒的作用，大劑量使用是否可導(dǎo)致患者脾胃功能失常、服用時間是否與抑制腫瘤有直接相關(guān)性等問題均值得我們思考。

對于藤梨根國內(nèi)學(xué)者也做了相關(guān)研究。李昊等〔5〕用不同濃度的藤梨根提取物作用胃癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其抑制率為88.10%，同樣也有一定的濃度和時間依賴性，而其機制可能與直接殺傷或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。衛(wèi)培峰等〔6〕應(yīng)用藤梨根提取物作用胃癌細(xì)胞48～96 h后發(fā)現(xiàn)與對照組相比細(xì)胞的凋亡率明顯下降，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后可發(fā)現(xiàn)加入藤梨根提取物后細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核不均勻，凋亡細(xì)胞胞體縮小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見顆粒小塊，而這些細(xì)胞形態(tài)均是凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。白吉慶〔7〕研究發(fā)現(xiàn)藤梨根提取物對胃癌SGC-7901細(xì)胞有明顯促凋亡作用;藤梨根提取物抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞 Bcl-2 蛋白水平的表達(dá)有可能是促進胃癌 SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用機制。以上研究并未將實體瘤分為不同證型去研究，由于藤梨根具有清熱作用，那么陽虛患者以及實寒證患者是否能使用值得我們下一步深入研究。

1 徐 飚,王建明.胃癌流行病學(xué)研究〔J〕中華腫瘤防治雜志,2006;13(1):1-3.

2 王秀娟.藤梨根干預(yù)食管癌細(xì)胞Ec9706/cDDPpolβ的研究〔D〕.鄭州:河南中醫(yī)學(xué)院,2007.

3 崔學(xué)梯.藤梨根干預(yù)食管癌細(xì)胞Ec9706/cDDPGST-π的研究〔D〕.鄭州:河南中醫(yī)學(xué)院,2007.

4 楊 帆.藤梨根中化學(xué)成分的研究〔D〕.成都：西南交通大學(xué),2004.

5 李 昊,楊慧萍.藤梨根對胃癌細(xì)胞抑制作用的實驗研究〔J〕.河北中醫(yī),2004;26(4):314-5

6 衛(wèi)培峰,焦晨莉,張三印.藤梨根提取物誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的實驗研究〔J〕.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005;28(5):52.

7 白吉慶.藤梨根提取物對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡及Bcl-2的影響〔J〕.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012;35(1):59-61.

〔2016-04-15修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of Rattan pear root extract on SGC7901 gastric cancer cell growth by intervening cell cycle and inducing apoptosis

DANG Hui,MU Zong-Ling,SONG Rui,etal.

The First Affiliated Hospital,Henan College of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450000,Henan,China

Objective To observe the inhibitory effect of Rattan pear root extract on gastric cancer SGC7901 cells and its mechanism. Methods MTT was used to detect different doses of Rattan pear root extract inhibition on proliferation of human gastric cancer SGC7901 cells. Cell cycle and apoptosis were detected.Results In the concentration range from 25 to 200 μg/ml,different concentrations of Rattan pear root extract had inhibitory effect on gastric cancer cells SGC7901 with concentration dependence. Treated with 53,86 μg/ml and 142 μg/ml Rattan pear root extract for 48 h,the SGC7901 in S phase ratio was increased,the apoptosis rate was increased significantly.Conclusions Rattan pear root extract might inhibit gastric cancer SGC7901 cells proliferation by intervening in the cell cycle and apoptosis,at the same time drug concentration has certain dependence.

Rattan pear root extract;Gastric cancer cells SGC7901;Cell apoptosis;Cell cycle

國家自然科學(xué)基金資助項目(81301726)；河南省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃(2010A360003)

高 萍(1957-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合惡性腫瘤和血液系統(tǒng)疾病的研究。

黨 輝(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治惡性腫瘤和血液系統(tǒng)疾病研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0786-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.003

1 山東體育學(xué)院