汪海波，高旭輝，朱健，郗二平，張瑜，王正，劉子豪，謝彪，朱水波

（中國人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院 心胸外科，湖北 武漢 430070）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的表型轉化與主動脈夾層（aortic dissection，AD）的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。VSMC的表型轉化與VSMC增殖遷移密切相關，當VSMC發(fā)生由收縮型向合成型的轉化后細胞的增殖遷移能力也相應增加。有研究[2]顯示，轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）可呈濃度依賴性誘導人主動脈VSMC增殖遷移，發(fā)生由收縮型向合成型的表型轉化。前期實驗研究[3]結果顯示，TGF-β1可誘導人主動脈VSMC（HA-VSMC）發(fā)生增殖與遷移，且ROCKI基因對TGF-β1誘導的HA-VSMCs遷移可能有抑制作用，而ROCKI和ROCKII基因對TGF-β1誘導的HA-VSMCs增殖均無明顯影響。本實驗進一步觀察ROCKI和ROCKII基因下調對TGF-β1誘導HA-VSMC收縮型標志物α-平滑肌肌動蛋白（smooth muscle α-actin，α-SMA）、平滑肌22α（smooth muscle 22α，SM22α）以及合成型標志物骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達的影響，從而探討ROCKI和ROCKII基因在TGF-β1誘導HA-VSMC轉化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞：HA-VSMC（美國ATCC公司）。主要試劑：TGF-β1（美國Peprotech公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰酶-EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone）；PBS（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液（100×）（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；TRIzol Reagent（Invitrogen?）；三氯甲烷、異丙醇以及無水乙醇（國藥集團化學試劑）；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR? Premix Ex Taq?（TaKaRa）；siRNA（廣州銳博）；Y-27632（美國Selleck）；Opti-MEM I Reduced serum medium（美國Gibco）；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（美國Invitrogen）；GAPDH（ab37168）、α-SMA（ab124964）、SM22α（ab14106）以及O P N（ab91655）（abcam公司）；HRP-Goat anti Rabbit（074-1506）（KPL）；GNM14170型D-Hanks（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）。主要儀器：SCO6WE型CO2恒溫培養(yǎng)箱（SHEL LAB）；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺（蘇凈安泰）；IX51型倒置顯微鏡（OLYMPUS）；TGL-16c型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TGL-16型冷凍離心機（湖南湘儀儀器）；IMS-20型制冰機（常熟市雪科電器有限公司）；基因擴增儀TC-XP型PCR儀（杭州博日科技）；StepOne? Real-Time PCR System型熒光定量PCR儀（Life technologies）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2條件下用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) HA-VSMCs。培養(yǎng)基按照1:100加入青鏈霉素混合液（含1000 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素）。HA-VSMC培養(yǎng)達85%～90%融合率時用胰酶消化細胞，用細胞計數(shù)板計數(shù)，稀釋至所需濃度，按照需要進行細胞干預及后續(xù)實驗。

1.2.2 siRNA轉染 ⑴ 轉染前1 d，胰酶消化收集細胞，加入不含抗生素的培養(yǎng)基，調整細胞密度為2×105/mL，以每孔2 mL接種至6孔板。轉染時要求細胞匯合度為50%～60%。⑵ 轉染液制備（siRNA儲存液濃度為20 μM），每孔用量如下：用 190 μL Opti-MEI無血清培養(yǎng)基將 10 μL siRNA稀釋，輕輕混勻。使用前輕輕搖勻Lipofectamine 2000，取 20 μL Lipofectamine 2000 在 18 μL 無血清培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5 min。將前2步縮稀釋的siRNA和Lipofectamine 2000混合（總體積400 μL），輕輕混勻，室溫靜置20 min。⑶ 將孔板內的培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，轉染孔加1.6 mL，空白孔加2 mL。⑷ 在需要轉染的孔中加入400 μL轉染液，輕輕搖勻。⑸ 37 ℃培養(yǎng)，轉染4～6 h后，細胞換液為含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，24 h后倒置顯微鏡下觀察轉染效果（綠色熒光），記錄圖片；轉染48 h后，用Western blot兩種轉染后的細胞、兩種轉染后的細胞加TGF-β1（5 ng/mL）處理以及HA-VSMC單純TGF-β1（5 ng/mL）處理后ROCKI和ROCKII蛋白的表達。

1.2.3 ROCKI和ROCKII對TGF-β1誘 導的HA-VSMC表型轉化 將細胞分成5組：⑴ 空白對照組（正常細胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h）；⑵ TGF-β1組（正常細胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h）；⑶ ROCKI siRNA+TGF-β1組（轉染ROCKI siRNA的 細胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h）； ⑷ ROCKII siRNA+TGF-β1組（ 轉 染ROCKII siRNA的細胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h）；⑸ Y-27632+TGF-β1組（正常細胞用10 μmol/mL ROCK非特異性抑制劑Y-27632預處理1 h，之后換培養(yǎng)液，在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h）。提取上述5組細胞內總蛋白進行Western blot和熒光定量PCR檢測α-SMA、SM22α、OPN蛋白表達水平及mRNA表達表達水平。各實驗重復3次。膠片掃描為TIF格式圖片，AlphaEaseFC軟件分析目標帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

結果用SPSS軟件做方差分析，不同組之間應用分析方法為ANOVA單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ROCKI和ROCKII的siRNA轉染結果以及轉染后ROCKI和ROCKII蛋白的表達

HA-VSMC轉染ROCKI和ROCKII的siRNA 24 h后，使用倒置顯微鏡觀察轉染結果，鏡下可見大量轉染成功的HA-VSMC（圖1）。Western bolt檢測結果顯示，HA-VSMC轉染ROCKI和ROCKII的siRNA 48 h后，細胞ROCKI和ROCKII蛋白表水平達較空白對照組明顯降低（均P＜0.05），TGF-β1處理能明顯升高HA-VSMC中ROCKI蛋白表水平（P＜0.05），但對ROCKII蛋白表水平明無明顯影響（P＞0.05），ROCKI siRNA轉染+TGF-β1處理的細胞中ROCKI蛋白表水平也較單獨TGF-β1處理的細胞明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

圖1 熒光顯微鏡檢測轉染結果（×100） A：ROCKI siRNA轉染；B：ROCKII siRNA轉染Figure 1 Transfection results observed by fluorescence microscope (×100) A: ROCKI siRNA transfection; B: ROCKII siRNA transfection

圖2 Western bolt檢測轉染后ROCKI/II蛋白表達 1：空白對照組；2：ROCKI siRNA轉染組；3：ROCKII siRNA轉染組；4：TGF-β1組；5：ROCKI siRNA轉染+TGF-β1組；6：ROCKII siRNA轉染+TGF-β1組Figure 2 Western bolt detection for ROCKI/II protein expressions after transfection 1: Blank control group; 2: ROCKI siRNA transfection group; 3: ROCKII siRNA transfection group; 4: TGF-β1 treatment group; 5: ROCKI siRNA transfection+TGF-β1 treatment group; 6: ROCKII siRNA transfection+TGF-β1 treatment group

2.2 ROCKI和ROCKII對TGF-β1誘導的HAVSMC表型標志物蛋白表達的影響

與空白對照組比較，TGF-β1組收縮型VSMC的標志物α-SMA、SM22α蛋白表達量明顯減少，而合成型VSMC的標志物OPN蛋白表達量明顯增加（均P＜0.05）。與TGF-β1組比較，ROCKI siRNA+TGF-β1組與Y-27632+TGF-β1組收縮型VSMC的標志物α-SMA、SM22α蛋白表達明顯增加，而合成型VSMC的標志物OPN蛋白表達量減少（均P＜0.05）；與TGF-β1組比較，ROCKIIsiRNA+TGF-β1組的收縮型VSMC的標志物α-SMA、SM22α和合成型VSMC的標志物OPN的蛋白表達量均無明顯差異（均P＞0.05）（圖3）。

2.3 ROCKI和ROCKII對TGF-β1誘導的HAVSMC表型標志物mRNA表達的影響

與空白對照組比較，TGF-β1組的收縮型VSMC的標志物α-SMA、SM22α的mRNA含量明顯減少，而合成型VSMC的標志物OPN的mRNA含量明顯增加（均P＜0.05）。與TGF-β1組比較，ROCKI siRNA+TGF-β1組與Y-27632+TGF-β1組收縮型VSMC的標志物α-SMA、SM22α的mRNA含量明顯增加，而合成型VSMC的標志物OPN的mRNA含量明顯減少（均P＜0.05）；與TGF-β1組相比，ROCKII siRNA+TGF-β1組的收縮型VSMC的標志物α-SMA、SM22α和合成型VSMC的標志物OPN的mRNA含量均無明顯差異（均P＞0.05）（圖4）。

圖3 Western bolt檢測各組α-SMA、SM22α及OPN蛋白表達量 1：空白對照組；2：TGF-β1組；3：ROCKI siRNA轉染+TGF-β1組；4：ROCKII siRNA轉染+TGF-β1組；5：Y-27632+TGF-β1組Figure 3 Western bolt analysis for protein expressions of α-SMA, SM22α and OPN in each group 1: Blank control group; 2: TGF-β1 treatment group; 3: ROCKI siRNA transfection+TGF-β1 treatment group; 4: ROCK II siRNA transfection+TGF-β1 treatment group;5: Y-27632+TGF-β1 treatment group

圖4 RT-PCR檢測各組α-SMA、SM22α及OPN mRNA含量 1：空白對照組；2：TGF-β1組；3：ROCKI siRNA轉染+TGF-β1組；4：ROCKII siRNA轉染+TGF-β1組；5：Y-27632+TGF-β1組Figure 4 RT-PCR detection of mRNA expressions of α-SMA, SM22α and OPN in each group 1: Blank control group; 2: TGF-β1 treatment group; 3: ROCKI siRNA transfection+TGF-β1 treatment group; 4: ROCK II siRNA transfection+TGF-β1 treatment group;5: Y-27632+TGF-β1 treatment group

3 討 論

AD是急診中常見的危急重癥，進展快且病死率高，多發(fā)生于青壯年男性[4]。近年來，隨著生活水平的提高及社會壓力的增加，國內AD的發(fā)生率呈逐年增加的趨勢。有關AD的研究顯示，AD的最初病變位于主動脈中膜層的平滑肌細胞[5-6]。相較于正常人，AD患者的VSMC增殖、遷移能力均增強，收縮型VSMC的標志物α-SMA、SM22α表達減少，而合成型VSMC的標志物OPN表達增加[7-9]。有研究[10]表明，在AD患者主動脈中膜層中TGF-β1的含量明顯較正常人主動脈組織中高。在TGF-β1的作用下HA-VSMC可發(fā)生由收縮型向合成型的表型轉化并且其增殖、遷移能力明顯增強[2,11]。

ROCK是Rho下游的效應器之一。ROCK的分子結構包括氨基酸端的催化結構域，中間的Rho結合α卷曲螺旋結構域和羧基端PH結構域。當激活狀態(tài)的Rho與ROCK的激酶結合結構域相互作用時，ROCK可發(fā)生多個氨基酸位點的磷酸化而被激活，從而引導其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應。ROCK蛋白在Rho/Rock信號通路中扮演重要作用，而該信號通路參與細胞的多種生物學行為，可調節(jié)細胞分裂、收縮、遷移、黏附、分泌等重要生命活動，是近年來研究比較熱門的一條重要信號轉導通路。ROCK包括ROCKI和ROCKII兩種異構體，兩者激酶區(qū)的同源性可達90%[12]。有研究[13]通過siRNA轉染下調ROCKI和ROCKII基因表達證實，ROCKI在大鼠平滑肌細胞的遷移中起主導作用，而ROCKII的作用不明顯；在大鼠平滑肌細胞的增殖中，兩者的作用均不明顯。此外，TGF-β1可通過Rho/ROCK信號通路刺激大鼠頸內平滑肌細胞（ISMC）表型轉化[14]。因此，ROCKI/II在TGF-β1刺激的HA-VSMC表型轉化中可能起到一定的作用。

本實驗采用體外培養(yǎng)HA-VSMC，通過轉染技術下調HA-VSMC的ROCKI和ROCKII基因表達，利用外源性TGF-β1刺激細胞。根據(jù)前期試驗結果[2]，本實驗選擇濃度為5 ng/mL的TGF-β1，作用時間為2 4 h。將細胞分為空白對照組、TGF-β1組，ROCKI siRNA+TGF-β1組，ROCKII siRNA+TGF-β1組和Y-27632+TGF-β1組進行Western bolt和RT-PCR檢測。其中，Y-27632為ROCK非特異性抑制劑。選取收縮型VSMC標志物α-SMA、SM22α和合成型VSMC標志物OPN，采用Western bolt和RT-PCR技術檢測相關VSMC表型轉化的標志物。與空白對照組相比，TGF-β1組的α-SMA、SM22α蛋白表達量和mRNA表達量減少而OPN蛋白表達量和mRNA表達量均增加，進一步證實TGF-β1可誘導HA-VSMCs發(fā)生由收縮型向合成型轉化。與TGF-β1組相比，ROCKI siRNA+TGF-β1組α-SMA、SM22α蛋白表達量和mRNA表達量增加而OPN蛋白表達量和mRNA表達量減少；ROCKII siRNA+TGF-β1組α-SMA、SM22α和OPN蛋白表達量和mRNA表達量均無顯著差異?？梢奟OCKI基因下調可抑制TGF-β1誘導HA-VSMCs由收縮型向合成型轉化的作用，而ROCKII基因下調后對TGF-β1誘導HAVSMC由收縮型向合成型轉化的作用無明顯影響。

綜上，在TGF-β1誘導下的HA-VSMC表型轉化中ROCKI起主要作用，而可能與ROCKII無關。此外，后續(xù)研究將通過穩(wěn)轉細胞系及過表達等技術進一步探究ROCKI和ROCKII對TGF-β1誘導HA-VSMC表型轉化的影響，從而為進一步探討HA-VSMC結構功能改變的分子機制及其與AD發(fā)病的關系提供了更多實驗依據(jù)，為抑制HA-VSMCs表型轉化提供潛在的治療靶點，并為臨床治療AD提供一定的研究基礎。

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