倪兆武，戴宇婷，陳睿彥

（昭通市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昭通 657000）

小兒顛茄合劑屬于解痙止痛醫(yī)院制劑，用于緩解胃腸痙攣引起的疼痛、惡心、嘔吐等，為各醫(yī)院常規(guī)制劑。微生物限度檢查作為控制藥品質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，為了保證方法的適、，可靠，按照《中國(guó)藥典》2015年版的規(guī)定，對(duì)小兒顛茄合劑的微生物限度檢查方法適用性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 樣品、培養(yǎng)基及試藥

小兒顛茄合劑（批號(hào)：160301、160314、160329），由某醫(yī)院提供。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA（批號(hào)：1 5 1 2 2 3）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基S D A（批號(hào)：1512292）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：160111）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：1512292）等培養(yǎng)基，以上均為北京三藥科技開發(fā)公司產(chǎn)品，并進(jìn)行過培養(yǎng)基適用性檢查。其他試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司生產(chǎn)），EZ-StreamTMPump六聯(lián)過濾系統(tǒng)（密理博公司生產(chǎn)），BHC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)），YXQ-LS-75G壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)），Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)）。

1.3 試驗(yàn)菌株

大腸埃希菌[CCMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]，以上均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，且菌株傳代次數(shù)均為2代。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 菌液的制備

分別將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、和黑曲霉培養(yǎng)物，用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌或孢子數(shù)小于1000CFU的菌或孢子懸液，備用。

2.2 供試品的制備

取每個(gè)批號(hào)樣品兩份，將其混合均勻并作為供試液，取供試液作為原液，取原液，再用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基將供試液進(jìn)一步稀釋成1：10、1：100的供試液。

2.3 微生物計(jì)數(shù)法

2.3.1 傾注法回收率測(cè)定

2.3.1.1 試驗(yàn)組

取各稀釋級(jí)供試液各9.9 mL，每個(gè)稀釋級(jí)5份，每份中加入0.1 mL的試驗(yàn)菌懸液后搖勻，吸取1mL注入無(wú)菌平皿中。加金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的平皿傾注15～20 mL溫度不超過45℃TSA，35℃培養(yǎng)3天，計(jì)數(shù)；加白色念珠菌、黑曲霉的平皿分別傾注15～20 mL溫度不超過45℃TSA和SDA，傾注TSA的平皿于35℃培養(yǎng)5天，傾注SDA的平皿于25℃培養(yǎng)5天，逐日觀察，計(jì)數(shù)。每種試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算數(shù)平均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

2.3.1.2 供試品對(duì)照組

取制備好的供試液1mL至平皿中，每個(gè)稀釋級(jí)平行4皿，其中2個(gè)傾注TSA，另2個(gè)傾注SDA，同法培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

2.3.1.3 菌液對(duì)照組

取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液，同法培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

2.3.1.4 空白實(shí)驗(yàn)

以稀釋液檢查，同法培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用常規(guī)法檢查，在TSA中：原液供試品對(duì)銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌人工染菌回收率均小于 50%，其余3種菌回收率在 0.5～2 范圍內(nèi)；1：10稀釋級(jí)對(duì)5種菌的人工染菌回收率均在 0.5～2 范圍內(nèi)。在沙氏 葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中：原液供試品對(duì)2種菌的人工染菌回收率均在0.5～2范圍內(nèi)。因此，本品原液需氧菌總數(shù)和霉菌及酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)未達(dá)到要求，需要消除其抑菌活性或重新選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ龠M(jìn)行驗(yàn)證。但1：10稀釋級(jí)的需氧菌總數(shù)和霉菌及酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果符合要求。見表1。

表1 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證結(jié)果（CFU/mL）

2.3.3 薄膜過濾法

2.3.3.1 加入30 mL無(wú)菌pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤(rùn)濕濾膜，取2.3.1.1、2.3.1.2、2.3.1.3的供試液及緩沖液1 mL過濾，用100 mL緩沖液沖洗，反復(fù)沖洗3次，并按2.3.1.1要求進(jìn)行培養(yǎng)；逐天觀察結(jié)果并記錄。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按傾注法回收率測(cè)定所述的計(jì)算公式，代入實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算。本品采用薄膜過濾法進(jìn)行測(cè)定，5種菌原液時(shí)的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)。見表2。

2.4 大腸埃希菌檢查方法

2.4.1 試驗(yàn)組

取原液及不大于100CFU的大腸埃希菌菌懸液各1 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，35℃培養(yǎng)18～24 h。取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24～48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上35℃培養(yǎng)18～72 h。

2.4.2 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)

接種不大于100CFU的大腸埃希菌至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，照試驗(yàn)組培養(yǎng)操作。

2.4.3 陰性對(duì)照試驗(yàn)

以稀釋液代替供試液照試驗(yàn)組培養(yǎng)操作，見表3。

表2 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證結(jié)果（CFU/mL）

表3 大腸埃希菌結(jié)果

3 討 論

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015版的相關(guān)規(guī)定，為了確認(rèn)所采用的方法適合用于某制劑的微生物限度檢查，必須對(duì)相應(yīng)檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。因無(wú)法判定小兒顛茄合劑的成分，工藝對(duì)需氧菌、霉菌和酵母菌以及控制菌大腸埃希菌的抑菌程度，因此對(duì)不同稀釋級(jí)的常規(guī)法進(jìn)行考察。通過實(shí)驗(yàn)表明，原液時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌抑菌明顯，回收率達(dá)不到要求，以1：10的稀釋級(jí)為最低稀釋級(jí)可以開展檢驗(yàn)，其次薄膜過濾法能很好消除抑菌影響，可以以原液為最低稀釋級(jí)。

[1] 中國(guó)藥典:四部[S].2015年:附錄136-151。

[2] 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2010:351-382

[3] 嚴(yán)曉明,劉 萌,等.四種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證[J].中國(guó)藥事2015,29(5):485-491

[4] 曹 云,郭曉娟.藥品微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證及其相關(guān)的技術(shù)問題[J].天津藥學(xué),2006,18(06):259-260.