張宇潔，樊珊珊，張?jiān)Ｅ?/p>

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安710021)

藥物在進(jìn)入人體內(nèi)后會(huì)與體內(nèi)的白蛋白發(fā)生不同程度結(jié)合，這種結(jié)合會(huì)延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的停留時(shí)間，但同時(shí)也會(huì)使藥物游離濃度減少，因此藥物與白蛋白的結(jié)合會(huì)改變藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等過(guò)程。在臨床上容易與白蛋白結(jié)合的藥物，在體內(nèi)的游離濃度較小，其代謝較慢，如果存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用的藥物，將會(huì)大幅度增加其游離濃度，進(jìn)而可能發(fā)生毒副反應(yīng)。當(dāng)游離藥物在組織或血液中被代謝后，結(jié)合態(tài)藥物與白蛋白通過(guò)發(fā)生解離來(lái)提高血液中游離藥物的濃度，從而保證藥物的療效。因此出于對(duì)藥物的安全性、有效性的考慮，研究藥物與白蛋白作用具有非常重要的意義。

歐前胡素、異歐前胡素是同分異構(gòu)體，都屬于6，7-呋喃香豆素類(lèi)，均具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、舒張血管活性等多種藥理活性[1-3]，目前有報(bào)道歐前胡素及異歐前胡素的藥代動(dòng)力學(xué)研究[4-5]，但其與蛋白的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。目前高效液相色譜與微透析技術(shù)聯(lián)用[6-9]，用于藥物與白蛋白的結(jié)合作用及藥物與蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究較多。作者采用HPLC結(jié)合平衡透析法建立測(cè)定歐前胡素與異歐前胡素同牛血清白蛋白結(jié)合率的方法，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

歐前胡素對(duì)照品:批號(hào)14110724，異歐前胡素對(duì)照品:批號(hào)14110715，牛血清白蛋白:批號(hào)14081710，均為上海士鋒生物科技有限公司;甲醇:色譜純，其它試劑均為分析純，均為天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

高效液相色譜儀:DIONEX P680，紫外檢測(cè)器:DIONEX UVD170U，美國(guó)戴安;酸度計(jì):E-201-9型，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱(chēng)取歐前胡素與異歐前胡素對(duì)照品各10 mg，加甲醇溶解搖勻，制備成歐前胡素與異歐前胡素質(zhì)量濃度為1.0 mg/m L的對(duì)照品，溶液于4℃冷藏備用。

1.2.2 牛血清白蛋白溶液

稱(chēng)取牛血清白蛋白適量，用二次蒸餾水溶解制成質(zhì)量濃度為40 mg/m L的溶液，置于4℃冰箱中，備用。

1.3 樣品的制備

分別精密量取異歐前胡素對(duì)照品溶液適量，加入袋外透析液中(透析液中加入0.005 g/m L的吐溫80作為增溶劑)，使透析外液的藥物質(zhì)量濃度分別為100、200、300μg/m L。

1.4 透析袋前處理

將透析袋剪成約10 cm長(zhǎng)的小段，用0.02 g/mL Na HCO3和1.0 mmol/L EDTA的混合液，將透析袋煮沸10 min，用蒸餾水徹底清洗后用30%乙醇浸泡，于4℃保存?zhèn)溆?，臨用前再用蒸餾水將透析袋清洗干凈。

1.5 樣品的處理

取BSA 1.0 m L加至透析袋中，平行3份。將透析袋置于盛有20 m L含藥PBS液的比色管中，37℃水浴震蕩，透析至平衡，取透析平衡后的袋外透析液200μL，離心10 min，取上清液10μL進(jìn)樣，測(cè)定袋外透析液中的歐前胡素和異歐前胡素藥物質(zhì)量濃度，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率Fb＝(ρtρf)/ρt×100%。其中，F(xiàn)b為藥物與蛋白的結(jié)合率;ρt為透析前透析液中藥物的總質(zhì)量濃度;ρf為平衡時(shí)透析液中游離藥物的質(zhì)量濃度。

1.6 色譜條件和系統(tǒng)適用性

色譜柱:250 mm×4.6 mm，5μm，流動(dòng)相:V(甲醇)∶V(水)＝70∶30，流速:1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm，柱溫:27℃，進(jìn)樣量:10μL，在此條件下測(cè)得歐前胡素與異歐前胡素的色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 歐前胡素、異歐前胡素高效液相色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別精密量取不同質(zhì)量濃度歐前胡素和異歐前胡素對(duì)照品溶液適量，用磷酸鹽緩沖液(p H＝7.4)稀釋?zhuān)謩e制成0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，取10μL注入HPLC中，在擬定的色譜分析條件下檢測(cè)。以歐前胡素和異歐前胡素的質(zhì)量濃度(mg/m L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程如下。歐前胡素:y＝222.37x＋0.210 7，r＝0.999 9(n＝6)，歐前胡素的線(xiàn)性范圍0.01～0.4 mg/m L;異歐前胡素:y＝121.31x＋0.232 6，r＝0.999 8(n＝6)，異歐前胡素的線(xiàn)性范圍0.01～0.4 mg/m L。

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)

分別吸取歐前胡素和異歐前胡素對(duì)照品溶液，用磷酸鹽緩沖液(p H＝7.4)配制成1.0 mg/m L的溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算歐前胡素和異歐前胡素的RSD值分別為0.5%和0.5%，

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取平衡透析后的歐前胡素和異歐前胡素樣品適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算歐前胡素與異歐前胡素峰的RSD值為1.3%、1.2%。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

吸取歐前胡素和異歐前胡素對(duì)照品溶液，用磷酸鹽緩沖液(p H＝7.4)配制成1.0 mg/m L的溶液，37℃恒溫箱放置，分別在配制后4、8、12、18、24 h取樣測(cè)定，計(jì)算歐前胡素的RSD值為2.7%，異歐前胡素的RSD值為2.2%，表明在兩種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 回收率實(shí)驗(yàn)

吸取已知含量的同一質(zhì)量濃度的樣品6份，分別加入歐前胡素與異歐前胡素對(duì)照品各10μg，透析平衡后取10μL注入HPLC中，計(jì)算回收率。歐前胡素與異歐前胡素的回收率分別為99.5%，98.9%。結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.2 平衡透析結(jié)合HPLC實(shí)驗(yàn)

2.2.1 結(jié)合率和結(jié)合常數(shù)的計(jì)算方法

透析袋臨用前在超純水中浸泡5 min，取含藥的20 m L透析液于比色管中，透析袋內(nèi)加入BSA1.0 m L，透析袋扎緊后，放入上述比色管中。37℃恒溫箱放置，直至結(jié)合態(tài)藥物與游離態(tài)藥物處于動(dòng)態(tài)平衡。藥物與蛋白的結(jié)合率計(jì)算方法與1.5相同。

2.2.2 透析平衡時(shí)間的確定

給透析袋內(nèi)加入1 m L磷酸鹽緩沖液，將其放入含藥100μL和20 m L透析液的比色管中，使袋外的歐前胡素和異歐前胡素藥物濃度分別為300、200、100μg/m L，37℃水浴振蕩，分別于4、8、12、16、18、24 h測(cè)定藥物的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明在12 h已達(dá)到了平衡，因此優(yōu)化平衡透析時(shí)間為12 h。

2.2.3 蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果

透析平衡后測(cè)定ρf，根據(jù)公式(1)，計(jì)算不同藥物濃度下的血漿蛋白結(jié)合率Fb。結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果(n＝3)

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，歐前胡素的蛋白結(jié)合率在79.3%，異歐前胡素的蛋白結(jié)合率約72.7%，蛋白結(jié)合率均較高，因此該藥物在臨床應(yīng)用時(shí)受患者病理狀態(tài)或其它藥物合用的交互作用可能有一定的影響，所以，同服其它藥物時(shí)，應(yīng)注意藥物間與血漿蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。

歐前胡素與異歐前胡素屬于香豆素類(lèi)化合物，難以溶于磷酸鹽緩沖液，作者采用0.005 g/m L的吐溫80作為增溶劑，由于時(shí)間問(wèn)題未探討吐溫80是否對(duì)牛血清白蛋白產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步研究。

藥物與白蛋白的結(jié)合作用及藥物與蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究除了高效液相色譜與微透析聯(lián)用的技術(shù)，還有采用超濾法與高效液相色譜聯(lián)用[10-11]，毛細(xì)管電泳法[12-13]，熒光光譜法[14]，紫外-可見(jiàn)分光光度法[15]等，每種方法各有特點(diǎn)，各方法之間的區(qū)別還有待進(jìn)一步研究。

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