陳麗莎 李燕明 佟訓(xùn)靚 趙作濤 王辰,5

(1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100730；3.北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)部，北京 100730；4.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034；5.國家呼吸疾病臨床研究中心 中日友好醫(yī)院呼吸中心 中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100029)

·論著·

煙曲霉孢子對肥大細胞活化作用的研究

陳麗莎1李燕明2佟訓(xùn)靚3趙作濤4王辰1,5

(1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100730；3.北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)部，北京 100730；4.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034；5.國家呼吸疾病臨床研究中心 中日友好醫(yī)院呼吸中心 中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100029)

目的 研究煙曲霉孢子對人肥大細胞系HMC-1的活化作用。方法 用加熱滅活的方法制備煙曲霉孢子抗原，體外培養(yǎng)人肥大細胞系HMC-1細胞，檢測熱滅活煙曲霉孢子誘導(dǎo)HMC-1細胞脫顆粒β-氨基己糖苷酶釋放比，酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)法檢測HMC-1細胞培養(yǎng)上清中白細胞介素-5 (IL-5)的釋放，Realtime-PCR檢測熱滅活煙曲霉孢子誘導(dǎo)的HMC-1細胞IL-5 mRNA的表達變化。結(jié)果 與陰性對照組相比，熱滅活煙曲霉孢子刺激后HMC-1細胞的β-氨基己糖苷酶釋放比升高[(11.3%±1.2%)VS(0.5%±0.1%)，P<0.05]，IL-5釋放增加[(11.96±1.09)VS(9.00±1.36)，P<0.05]，IL-5 mRNA表達上調(diào)[(2.47±0.12)VS(0.00±0.26)，P<0.05]。結(jié)論 熱滅活煙曲霉孢子誘導(dǎo)HMC-1肥大細胞活化，引起細胞活化脫顆粒、合成和釋放IL-5增加。

煙曲霉；孢子；肥大細胞；脫顆粒；白細胞介素-5

煙曲霉是自然環(huán)境中廣泛存在的條件致病真菌，其產(chǎn)生的氣傳孢子，可被吸入呼吸道末端，引起曲霉致敏相關(guān)的疾病，例如過敏性哮喘、過敏性肺炎、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病 (Allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)等疾病。同時環(huán)境中煙曲霉孢子濃度升高與疾病癥狀加重密切相關(guān)，如高濃度的煙曲霉孢子與哮喘癥狀加重和病死率升高具有相關(guān)性[1]，體內(nèi)實驗已證實煙曲霉孢子暴露可以引起哮喘模型大鼠氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥加重[2]。肥大細胞是重要的效應(yīng)和調(diào)節(jié)性免疫細胞，可以脫顆粒釋放組胺等炎癥介質(zhì)、合成并釋放細胞因子和趨化因子等，與變態(tài)反應(yīng)性疾病如過敏性哮喘、蕁麻疹等關(guān)系密切。目前已知煙曲霉含有23種抗原成分[3]，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性IgE并與之共同結(jié)合在肥大細胞表面的IgE受體上，誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞還可以通過多種非IgE依賴活化途徑參與真菌致敏的免疫調(diào)節(jié)[4]，白念珠菌、申克孢子絲菌等真菌均被發(fā)現(xiàn)可以通過非IgE依賴途徑活化肥大細胞[5-6]，引起肥大細胞脫顆粒或合成并釋放相關(guān)細胞因子。體外實驗發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌絲可以直接誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒[7]，提示肥大細胞除經(jīng)典的IgE途徑外，還存在非IgE依賴的活化通路參與煙曲霉致敏的免疫調(diào)節(jié)過程。本實驗通過研究加熱滅活的煙曲霉孢子抗原對肥大細胞的活化作用，增加對肥大細胞在煙曲霉致敏時免疫調(diào)節(jié)功能的認識。

1 材料與方法

1.1 菌株

煙曲霉 (Aspergillusfumigatus)AF293，由北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心提供。

1.2 試劑

4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷 (4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide，美國Sigma公司)，鈣離子載體A23187 (Calcium ionophore A23187,比利時Acros公司)。沙氏葡萄糖瓊脂 (英國Oxoid公司)。細胞培養(yǎng)用IMDM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素購自美國Gibco公司。RNA提取試劑盒 (美國Omega公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (日本Takara公司)、SYBR Green PCR Master Mix (美國Invitrogen公司)、人IL-5 ELISA試劑盒 (美國RayBiotech公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)

人肥大細胞系HMC-1，購自上海酶研生物科技有限公司。HMC-1細胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中，放于37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d傳代，細胞密度維持在2×105～1×106/mL之間。

1.4 煙曲霉孢子抗原的制備

參照文獻[8]，用加熱法制備滅活的煙曲霉孢子抗原：(1)煙曲霉AF293接種在沙氏瓊脂糖培養(yǎng)基 (SAD)35℃培養(yǎng)5 d。(2)0.01%吐溫80生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面收集煙曲霉分生孢子，通過8層無菌紗布過濾除去菌絲，將孢子懸液3 000 g×10 min離心，重懸于無菌PBS緩沖液中。(3)將煙曲霉孢子計數(shù)后接種至無血清的1640培養(yǎng)基中，35℃恒溫搖床100 r/min，搖菌8 h。(4)收取孢子，鏡下觀察確認孢子腫脹以更加充分暴露抗原，3 000 g離心10 min，重懸于無菌PBS緩沖液中，光學(xué)顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子懸液濃度為1×108/mL。(5)孢子懸液放入100℃金屬浴中加熱1 h，制成滅活煙曲霉孢子抗原，保存于-80℃?zhèn)溆谩?6)接種100 μL的滅活孢子懸液于沙氏瓊脂糖平皿中，27℃培養(yǎng)10 d確保孢子全部滅活。

1.5 β-氨基己糖苷酶釋放試驗

β-氨基己糖苷酶釋放試驗是反映肥大細胞脫顆粒程度的經(jīng)典試驗之一。方法參照Romo-Lozano等人[6]研究。取對數(shù)生長期的HMC-1細胞，臺盼藍染色后顯微鏡下檢查細胞活力大于95%，細胞重懸在未添加血清、抗生素的無酚紅IMDM培養(yǎng)液中，接種于96孔中 (密度1×106/mL)，每孔100 μL，設(shè)陰性對照組、陽性對照組 (A23187，20 μmol/L)、HKAFS組 (熱滅活煙曲霉孢子，5×105/mL)，每組3個復(fù)孔。HMC-1細胞與A23187、HKAFS于37℃細胞培養(yǎng)箱中共孵育3 h后，離心留取細胞培養(yǎng)上清液和細胞沉淀。細胞沉淀在含0.1%TritonX-100的無血清、抗生素及酚紅的IMDM培養(yǎng)液中充分裂解后離心留取上清為細胞裂解液。培養(yǎng)上清液和細胞裂解液各取40 μL加入96孔板中，加40 μL葡萄糖苷檸檬酸溶液 (2 mmol/L 4-硝基苯-N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷+62.5 mmol/L檸檬酸一水合物+100 mmol/L無水磷酸氫二納，pH=4.5)，37℃孵育1 h后加入100 μL甘氨酸液 (0.2 mol/L甘氨酸，pH=10.7)終止反應(yīng)，酶標儀測定405 nm波長處各孔反應(yīng)液的吸光度。β-氨基己糖苷酶釋放比表示為：β-氨基己糖苷酶釋放比 (%)=(培養(yǎng)上清液OD405-本底液OD405)/(培養(yǎng)上清液OD405+細胞裂解液OD405-本底液OD405)×100%。

1.6 ELISA法檢測IL-5細胞因子釋放

取對數(shù)生長期、細胞活力大于95%的HMC-1細胞，細胞重懸在含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，細胞接種濃度、熱滅活煙曲霉孢子刺激濃度同前，共孵育6 h后，按ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)上清液IL-5釋放水平。

1.7 Realtime-PCR檢測IL-5mRNA表達

取對數(shù)生長期、細胞活力大于95%的HMC-1細胞，細胞重懸在含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，接種于24孔板中 (細胞密度1×106/mL)，設(shè)陰性對照組、HKAFS組 (孢子濃度1×106/mL)，每組3個復(fù)孔,共孵育3 h后，收集細胞提取總mRNA，用于Realtime-PCR檢測。Realtime-PCR IL-5 (73 bp)上游引物：AAGAGACCTTGGCACTGCTTTC，下游引物：GGAACAGGAATCCTCAGAGTCTCA。采用GAPDH (104 bp)為內(nèi)參，上游引物：AAGATCATCAGCAATGCCTCC，下游引物：TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT。采用ABI prism 7500 PCR儀 (Applied Biosystems)檢測IL-5 基因的表達，結(jié)果使用相對定量2-ΔΔCt法[9]計算分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 加熱滅活煙曲霉孢子形態(tài)及驗證滅活

收集煙曲霉腫脹孢子100℃加熱滅活制成滅活煙曲霉孢子抗原，光學(xué)顯微鏡下觀察煙曲霉孢子加熱前后無明顯形態(tài)改變，孢子結(jié)構(gòu)未見明顯破壞 (見圖1)。接種加熱滅活煙曲霉孢子懸液于沙氏瓊脂糖平皿中，25℃培養(yǎng)10 d后未見煙曲霉菌落生長 (見圖2a)，加熱滅活煙曲霉孢子與HMC-1細胞在完全IMDM培養(yǎng)液中37℃共培養(yǎng)24 h，未見煙曲霉菌絲生長 (見圖2b)，驗證了煙曲霉孢子被滅活，排除煙曲霉孢子生長感染細胞干擾實驗結(jié)果。

2.2 煙曲霉孢子引起HMC-1細胞β-氨基己糖苷酶釋放增加

將熱滅活的煙曲霉孢子和陽性對照物A23187與HMC-1細胞共孵育3 h后，檢測β-氨基己糖苷酶釋放比，A23187組、HKAFS組比陰性對照組明顯增高，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (11.3%±1.2%、6.1%±0.7% VS 0.5%±0.1%，P<0.05)，A2318組比HKAFS組高，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (11.3%±1.2% VS 6.1%±0.7%，P<0.05)，說明A23187和熱滅活煙曲霉孢子均能夠引起HMC-1細胞脫顆粒，熱滅活煙曲霉孢子誘導(dǎo)的細胞脫顆粒程度低于陽性對照刺激物A23187，熱滅活煙曲霉孢子不是肥大細胞脫顆粒的強誘導(dǎo)物。結(jié)果見圖3。

2.3 熱滅活煙曲霉孢子促進HMC-1細胞釋放IL-5

將熱滅活煙曲霉孢子與HMC-1細胞共孵育6 h后，用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-5釋放程度，結(jié)果如圖4所示，HKAFS組明顯高于陰性對照組，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (11.96±1.09 ng/mL VS 9.00±1.36 ng/mL,P<0.05)，提示熱滅活煙曲霉孢子能夠促進HMC-1細胞釋放IL-5。

2.4 熱滅活煙曲霉孢子引起HMC-1細胞IL-5 mRNA表達上調(diào)

將熱滅活煙曲霉孢子與HMC-1細胞共孵育3 h，Realtime-PCR法檢測細胞IL-5 mRNA的相對表達量，結(jié)果如圖5所示，HKAFS組基因相對表達量較陰性組顯著升高，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (2.47±0.12 VS 0.00±0.26,P<0.05)，說明熱滅活煙曲霉孢子誘導(dǎo)HMC-1細胞IL-5基因表達上調(diào)。

3 討 論

煙曲霉是常見的致敏真菌，哮喘患者約有16%～38%的患者對曲霉皮膚試驗陽性，其中煙曲霉致敏占97%[10]，煙曲霉致敏在重癥哮喘中發(fā)生率高達51%。煙曲霉與哮喘癥狀加重有關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中煙曲霉孢子濃度升高與哮喘癥狀加重和病死率升高相關(guān)，煙曲霉致敏加重肺功能受損[1]，體內(nèi)實驗顯示吸入煙曲霉孢子可以加重卵清蛋白 (Ovalbumin，OVA)致敏哮喘模型大鼠的氣道炎癥和氣道反應(yīng)性[2]。然而煙曲霉孢子暴露加重哮喘癥狀的機制尚不明確。

肥大細胞是速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的初級效應(yīng)細胞，其活化同時影響次級效應(yīng)細胞例如嗜酸性粒細胞等的募集與激活。肥大細胞活化可以通過多種方式被誘發(fā)，IgE依賴的免疫機制是其脫顆粒的主要方式。近年來大量研究顯示肥大細胞還存在多種非IgE依賴活化途徑,例如Toll樣受體、C型凝集素受體、補體受體等受體，可以與相應(yīng)物質(zhì)結(jié)合后誘導(dǎo)肥大細胞活化，參與真菌致敏的免疫調(diào)節(jié)過程[4]。白念珠菌的酵母和菌絲可以通過Dectin1受體通路誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒、合成和釋放多種細胞因子[5]，申克孢子絲菌孢子直接引起肥大細胞釋放細胞因子并增加其組胺的釋放潛能[6]。肥大細胞的非IgE依賴活化途徑在真菌致敏中發(fā)揮了重要免疫調(diào)節(jié)作用。

圖1 100×10倍光學(xué)顯微鏡下煙曲霉孢子形態(tài) (a.未加熱滅活的煙曲霉孢子,b.加熱滅活煙曲霉孢子) 圖2 驗證加熱煙曲霉孢子滅活 (a.加熱滅活煙曲霉孢子接種于沙氏瓊脂糖平皿中，25℃培養(yǎng)10 d后未見煙曲霉菌落生長；b.加熱滅活煙曲霉孢子與HMC-1細胞在完全IMDM培養(yǎng)液中37℃共培養(yǎng)24 h，20×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察未見煙曲霉菌絲生長) 圖3 HMC-1細胞β-氨基己糖苷酶釋放比 (A23187.陽性對照組；HKAFS.加熱滅活煙曲霉孢子組；A23187組、HKAFS組 VS 陰性對照組，A23187組 VS HKAFS組，*.P<0.05) 圖4 ELISA法檢測HMC-1細胞培養(yǎng)上清中IL-5水平 (HKAFS.加熱滅活煙曲霉孢子組；HKAFS組 VS 陰性對照組，*.P<0.05) 圖5 Realtime-PCR法檢測HMC-1細胞IL-5 mRNA表達水平 (HKAFS.加熱滅活煙曲霉孢子組；HKAFS組 VS 陰性對照組，*.P<0.05)

Fig.1 The morphology ofAspergillusfumigatusspores observed by optical microscope (Optical magnification 100×10;a.naturalAspergillusfumigatusspores;b.heat-killedAspergillusfumigatusspores) Fig.2 Inactivation of heat-killedAspergillusfumigatusspores (a.Planting the heat-killedAspergillusfumigatusspores on SAB in 25℃ temperature for 10 days,no colonies grew on the plate;b.Heat-killedAspergillusfumigatusspores and HMC-1 were co-cultured in complete IMDM medium in 37℃ for 24 hours,no hyphae were observed under the 200× optical microscope) Fig.3 The release of β-hexosaminidase by HMC-1 (A23187.positive control group,HKAFS.heat-killedAspergillusfumigatusspores group;A23187,HKAFS VS Control，A23187 VS Control，*.P<0.05) Fig.4 Supernatants IL-5 levels measured by ELISA (HKAFS.heat-killedAspergillusfumigatusspores group;HKAFS VS Control,*.P<0.05) Fig.5 The expression of IL-5 mRNA on HMC-1 by Realtime-PCR (HKAFS.heat-killedAspergillusfumigatusspores group;HKAFS VS Control,*.P<0.05)

2009年Mirjam等[7]發(fā)現(xiàn)成熟的煙曲霉菌絲可以通過非IgE依賴途徑直接接觸肥大細胞引起肥大細胞脫顆粒，首次發(fā)現(xiàn)了煙曲霉通過非IgE依賴途徑活化肥大細胞，但作用的具體機制并不明確，也未說明煙曲霉孢子的對肥大細胞的活化作用。本研究探討煙曲霉孢子抗原對肥大細胞的直接活化作用，參照文獻[8]方法，用加熱的方法將煙曲霉孢子制成滅活的孢子抗原，以充分暴露孢子表面的抗原，同時避免煙曲霉孢子與細胞共孵育時繼續(xù)萌芽生長成菌絲感染細胞干擾實驗結(jié)果。在體外條件下將加熱滅活煙曲霉孢子抗原與人肥大細胞系HMC-1共孵育，檢測HMC-1細胞的β-氨基己糖苷酶釋放比。β-氨基己糖苷酶釋放比試驗是檢測肥大細胞脫顆粒程度的經(jīng)典實驗方法，本研究發(fā)現(xiàn)，在無特異性IgE存在的條件下，加熱滅活煙曲霉孢子組的β-氨基己糖苷酶釋放比的值顯著高于陰性對照組 (P<0.05)，但略低于陽性對照組，說明加熱滅活煙曲霉孢子抗原能夠在一定程度上引起HMC-1細胞脫顆粒，但不是肥大細胞脫顆粒的強誘導(dǎo)物。此結(jié)果提示，煙曲霉孢子可能使肥大細胞活化并釋放組胺、白三烯、類胰蛋白酶等炎癥介質(zhì)，從而引起并加重氣道炎癥，煙曲霉孢子暴露造成哮喘患者癥狀的急性加重，可能與煙曲霉孢子對肥大細胞的活化作用相關(guān)。

IL-5是引起哮喘癥狀的重要細胞因子之一。IL-5能夠促進嗜酸性粒細胞的分化成熟，同時也是嗜酸性粒細胞的強趨化因子，與嗜酸性粒細胞炎癥形成和嗜酸性粒細胞活化密切相關(guān)[11]。嗜酸性粒細胞及其合成釋放的多種炎癥介質(zhì)與重癥哮喘關(guān)系密切[12]，嗜酸性粒細胞顯著升高是煙曲霉引起的變應(yīng)性支氣管肺曲霉病的主要特征之一[13]。研究顯示，對嗜酸性粒細胞增多型哮喘患者，抗IL-5以及抗IL-5Ra治療效果顯著[14]。肥大細胞是IL-5的主要來源之一[15]，肥大細胞活化可能會通過其釋放的IL-5促進嗜酸性粒細胞炎癥形成，加重哮喘癥狀。本實驗將熱滅活的煙曲霉孢子與HMC-1細胞共孵育，用Realtime-PCR的方法檢測HMC-1細胞IL-5 mRNA的表達，用Elisa法檢測HMC-1細胞上清液中IL-5的釋放水平，分別在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平驗證了加熱滅活煙曲霉孢子抗原引起HMC-1細胞表達、釋放IL-5增加。本研究提示，煙曲霉孢子誘導(dǎo)肥大細胞IL-5的釋放，IL-5參與促進氣道嗜酸性粒細胞浸潤和炎癥形成等生物學(xué)功能已經(jīng)被證實，因此，煙曲霉孢子誘導(dǎo)肥大細胞的活化可能是整個致敏過程的始動因素。

此次實驗結(jié)果初步驗證了加熱滅活煙曲霉孢子抗原能夠直接活化HMC-1細胞，引起HMC-1細胞脫顆粒、合成并釋放IL-5，證實了加熱滅活煙曲霉孢子抗原能夠經(jīng)非IgE依賴途徑活化肥大細胞，為認識煙曲霉和肥大細胞相互作用提供了實驗支持。

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[本文編輯] 王 飛

Effects ofAspergillusfumigatusspore on the activation of mast cell

CHEN Li-Sha1,LI Yan-Ming2,TONG Xun-Liang3,ZHAO Zuo-Tao4,WANG Chen1,5

(1.PekingUniversityChina-JapanFriendshipSchoolofClinicalMedicine,Beijing100029;2.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,BeijingHospital,Beijing100730;3.DepartmentofGeriatrics,BeijingHospital,Beijing100730;4.DepartmemtofDermatovenerology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,Beijing100034;5.NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDiseases,CenterforRespiratoryDiseases,China-JapanFriendshipHospital,DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029)

ObjectiveTostudytheeffectsofAspergillus fumigatussporeontheactivationofhumanmastcelllineHMC-1.MethodsPreparedheat-killedAspergillus fumigatussporeantigenbyheatingmethod.HMC-1cellswereco-culturedwithheat-killedAspergillus fumigatussporeswhoseconcentrationwas5×105.Microplatespectrophotometerwasappliedtotheβ-hexosaminidasereleaseassaywhichwasanindexofmastcelldegranulation.Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)wasusedforreleasedIL-5.TheexpressionlevelsofIL-5mRNAwasdetectedbyRealtime-PCR.ResultsComparedwiththenegativecontrolgroup,heat-killedAspergillus fumigatussporesincreasedβ-hexosaminidaserelease[(11.3%±1.2%)VS(0.5%±0.1%),P<0.05],IL-5mRNAexpressionlevel[(2.47±0.12)VS(0±0.26),P<0.05]andthereleaseofIL-5 [(11.96±1.09)VS(9±1.36),P<0.05]inHMC-1cells.ConclusionAspergillus fumigatussporesactivatesmastcelllineHMC-1resultingincelldegranulation,synthesisandreleaseofIL-5.

Aspergillus fumigatus;spore;mastcell;degranulation;interleukin-5

3-7]

國家十二五科技支撐計劃 (2012BAI 05B02)

陳麗莎，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:lychenls@qq.com

王辰,E-mail:cyh-birm@263.net

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0003-05

2017-01-25