魯仁義 馬錢瑤 張曉龍 曹永兵 王彥 閻瀾 姜遠(yuǎn)英

(1.中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

·綜述·

白念珠菌Ras/cAMP/PKA通路的研究進(jìn)展

魯仁義1馬錢瑤2張曉龍1曹永兵1王彥1閻瀾1姜遠(yuǎn)英1

(1.中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

白念珠菌是一種重要的條件致病真菌，Ras/cAMP/PKA信號(hào)通路在白念珠菌的多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用，如形態(tài)轉(zhuǎn)換、黏附、生物被膜形成等，對(duì)于維持白念珠菌的毒力以及侵襲能力是十分重要的。對(duì)這一信號(hào)通路的深入研究有助于更好地了解白念珠菌對(duì)人體致病的機(jī)制，給抗真菌新藥的研發(fā)提供新的思路。該文重點(diǎn)闡述通路相關(guān)蛋白功能、上下游調(diào)控關(guān)系及機(jī)制。

白念珠菌；Ras/cAMP/PKA信號(hào)通路；形態(tài)轉(zhuǎn)換

由于器官移植術(shù)后免疫抑制劑的使用，腫瘤放療化療患者的增加，介入治療和駐ICU患者的增加，艾滋病的流行和廣譜抗生素的大量使用等原因，侵襲性真菌感染發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。

白念珠菌是最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病真菌，主要侵襲和感染機(jī)體口腔黏膜、消化道、陰道等部位，在免疫力低下人群中易引發(fā)系統(tǒng)性念珠菌感染，累及多個(gè)臟器[2]。白念珠菌有酵母態(tài)及菌絲態(tài)兩種形態(tài)，形態(tài)轉(zhuǎn)換對(duì)于白念珠菌的致病力是至關(guān)重要的，在機(jī)體內(nèi)，菌絲態(tài)的白念珠菌具有更強(qiáng)侵襲性。

菌絲形成、形態(tài)轉(zhuǎn)換、生物被膜形成、甾醇合成、糖酵解等一系列生物和代謝過(guò)程對(duì)白念珠菌的生長(zhǎng)繁殖及致病力都是十分重要的[3-4]，這些過(guò)程由多條信號(hào)通路參與調(diào)控，其中Ras/cAMP/PKA通路至關(guān)重要[5]，有望從中發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物新的重要靶點(diǎn) (見(jiàn)圖1)。本文綜述了白念珠菌Ras/cAMP/PKA信號(hào)通路中各相關(guān)分子的上下游關(guān)系及分子調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)闡述通路中關(guān)鍵基因及蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

1 Ras、Ira2和Cdc25

Ras是高度保守GTP酶家族中的成員，在許多重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化信號(hào)通路中起著重要的“分子開(kāi)關(guān)”的作用。

圖1 白念珠菌中Ras/cAMP/PKA通路示意圖(黑色箭頭表示激活作用，紅色線表示抑制作用)

Fig.1 Schematic diagram of Ras/cAMP/PKA pathway inCandidaalbicans(Black arrows indicate activation and red lines indicate suppression)

Ras屬于小G蛋白家族 (與普通G蛋白由αβγ三個(gè)亞基組成異三聚體不同，以單體分子存在，并且分子量只有20～35 kD)，Ras有GTP結(jié)合的活化狀態(tài)和GDP結(jié)合的非活化狀態(tài)兩種存在形式，當(dāng)其處于活化狀態(tài)時(shí)，可使下游的效應(yīng)分子活化，兩者之間的轉(zhuǎn)換依賴于Ras本身具有的GTP酶活性[6]。

RAS1在白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[7]，能促進(jìn)菌絲的形成，當(dāng)RAS1基因被敲除后，白念珠菌生長(zhǎng)減慢、呈假菌絲樣生長(zhǎng)、菌絲形成能力減弱、胞內(nèi)cAMP水平顯著降低，將Ras1第13位的甘氨酸突變成纈氨酸后，Ras1活性顯著增強(qiáng)，胞內(nèi)cAMP含量升高且菌絲形成能力增強(qiáng)[8]。除Ras1外，白念珠菌中還存在另一個(gè)非典型的鳥苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白R(shí)as2，Ras2與Ras1有拮抗作用，RAS2單敲除的菌株增殖速度、cAMP含量以及菌絲生長(zhǎng)基本與野生型一致，但RAS1和RAS2雙敲除的菌株中，cAMP的含量是親本菌的30%，但比RAS1單敲除菌株高約6～7倍，且生長(zhǎng)速率恢復(fù)到親本菌水平[9]。以上結(jié)果表明RAS1在白念珠菌中cAMP水平調(diào)控、菌絲生長(zhǎng)及形態(tài)轉(zhuǎn)換發(fā)揮著重要的作用。另外，最新研究表明，在RAS1缺失菌中，由TORC1介導(dǎo)的核糖體生物合成減少，從而導(dǎo)致了菌株對(duì)兩性霉素B耐受性升高[10]。

葡萄糖和血清無(wú)法誘導(dǎo)RAS1缺失菌中cAMP生成，RAS1缺失菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的缺陷可以通過(guò)外源性cAMP解救，這兩種表型在CDC25缺失菌中也能觀察到[11]，表明CDC25和RAS1是在cAMP-PKA通路的上游發(fā)揮作用的。Cdc25是參與Ras1-GTP/GDP轉(zhuǎn)換的鳥苷酸交換因子，能夠激活Ras1，當(dāng)CDC25被敲除后，菌株中Ras1-GTP水平降低并且不能形成菌絲[12]。而Ira2能夠激活Ras1的GTP酶活性，負(fù)性調(diào)控Ras1的活性，使Ras1-GTP分解為Ras1-GDP，IRA2缺失會(huì)導(dǎo)致Ras1/cAMP/PKA通路的持續(xù)激活，進(jìn)而增強(qiáng)菌絲生成[13]。此外，Seneviratne等[14]通過(guò)篩選單倍體突變文庫(kù)，揭示了IRA2還參與了生物被膜的形成，發(fā)揮著正向調(diào)控的作用。最新的研究表明[12]，白念珠菌中Ras1的活性與線粒體活性也密切相關(guān)，線粒體抑制劑能夠顯著減少Ras1與GTP的結(jié)合，并且在其他念珠菌中也能觀察到類似的效應(yīng)。線粒體氧化呼吸活性和Ras1-GTP結(jié)合之間有密切關(guān)系，缺少?gòu)?fù)合物I或復(fù)合物IV的菌株在菌絲誘導(dǎo)條件下依然呈酵母狀生長(zhǎng)，并且具有較低水平的Ras1-GTP。

2 Cyr1、Srv2、Gpr1和Gpa2

CYR1 (又稱CDC35)在白念珠菌中負(fù)責(zé)編碼腺苷酸環(huán)化酶 (adenylate cyclase，AC)，CYR1缺失菌菌絲形成缺陷，cAMP含量下降。AC在細(xì)胞內(nèi)的的作用是催化ATP生成cAMP，在白念珠菌的凋亡、CO2感知等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是Ras1的下游效應(yīng)物。在Fang等[8]的研究中，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明Ras1是與Cyr1的RA (Ras-association)結(jié)構(gòu)域相互作用而發(fā)揮激活A(yù)C作用的，當(dāng)Ras1與GTP結(jié)合時(shí)，可以與AC上保守的RA結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活A(yù)C的活性提高cAMP的水平。此外，在低pH的環(huán)境下，CYR1的表達(dá)下調(diào)，菌絲生長(zhǎng)缺陷，說(shuō)明CYR1在白念珠菌適應(yīng)不同pH環(huán)境中也發(fā)揮著作用[15]。

Srv2是一個(gè)AC相關(guān)蛋白，能夠調(diào)節(jié)AC的活性，參與調(diào)控白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換等生理過(guò)程，SRV2在釀酒酵母中的同源基因是CAP1，SRV2缺失菌在小鼠系統(tǒng)性念珠菌感染模型中毒力喪失[16]，像通路中的其他突變體一樣，SRV2缺失菌有形態(tài)轉(zhuǎn)換缺陷，又可以通過(guò)添加cAMP或dbcAMP解救。有研究發(fā)現(xiàn)Srv2能夠通過(guò)它的N-端和C-端分別連接Cyr1和G-actin，形成一個(gè)三聚體，在菌絲生長(zhǎng)時(shí)起著激活cAMP合成的作用[17]。

在真核細(xì)胞中，G蛋白偶聯(lián)受體能夠調(diào)控多種信號(hào)通路，當(dāng)其與配體結(jié)合后，本身構(gòu)象發(fā)生改變激活效應(yīng)蛋白，將信號(hào)傳遞至下游的效應(yīng)器分子，包括腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶C[18]。

Gpr1是真菌細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體，由GPR1編碼，在白念珠菌中其真正的配體是什么仍然存在爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為是葡萄糖，也有研究認(rèn)為是氨基酸尤其是甲硫氨酸發(fā)揮著與受體結(jié)合的作用[19]。在GPR1缺失菌中，Gα蛋白即Gpa2的組成性激活能夠解救其在菌絲形成中的缺陷至與野生菌一致，說(shuō)明GPR1在GPA2的上游發(fā)揮作用[11]，Gpa2是由GPA2基因編碼的G蛋白α亞基，與Gpr1能夠相互作用，Gpr1的C端連接Gpa2后，后者能夠激活A(yù)C。在GPR1或者GPA2的缺失菌中，白念珠菌在固體培養(yǎng)基中菌絲形成和形態(tài)轉(zhuǎn)換都有障礙，但是在液體培養(yǎng)基中并沒(méi)有缺陷并且毒力保持完整[11,20]。此外，Ballou等[21]發(fā)現(xiàn)當(dāng)白念珠菌暴露于乳酸中時(shí)，Gpr1能夠幫助其掩蔽β-葡聚糖從而逃避免疫系統(tǒng)的檢測(cè)。

3 Pde2和cAMP

cAMP是生物體內(nèi)重要的第2信使分子，cAMP激活PKA (cAMP依賴性蛋白激酶)，使靶蛋白磷酸化，產(chǎn)生后續(xù)的效應(yīng)，最后cAMP被磷酸二酯酶 (Pde)水解成5'-AMP而失活，發(fā)揮這一作用的主要是由PDE2編碼的磷酸二酯酶2蛋白 (Pde2)。

Jung等[22]發(fā)現(xiàn)白念珠菌PDE2缺失菌表現(xiàn)出細(xì)胞壁和細(xì)胞膜性質(zhì)改變相關(guān)表型，例如對(duì)膜干擾劑熒光素白和抗真菌藥物氟胞嘧啶的敏感性增加，同時(shí)細(xì)胞壁組成成分中麥角甾醇和葡聚糖的含量也發(fā)生了改變，導(dǎo)致細(xì)胞壁厚度減少了大約25%。PDE2缺失菌對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺失的敏感性顯著升高，37℃下PDE2缺失菌在PBS中4 h后死亡超過(guò)50%，而野生菌超過(guò)90%依然存活[23]。另外PDE2缺失菌的體外黏附能力和侵襲能力也有所下降[24]。

在白念珠菌出芽過(guò)程中，PDE2的高表達(dá)能夠拮抗SRV2激活的cAMP合成，抑制菌絲的生成，在PDE2缺失菌中，觀察到了高水平的cAMP和菌絲的超常生長(zhǎng)，但是超常菌絲生長(zhǎng)的狀態(tài)和無(wú)菌絲狀態(tài)都是毒力缺失的[23]。

在瓊脂培養(yǎng)基上，野生型菌株形成由出芽酵母構(gòu)成的光滑菌落，而在同樣的條件下，純合的PDE2缺失菌表現(xiàn)出皺褶的菌落表型，褶皺的菌落由假菌絲和真菌絲混合而成[23]。綜上，我們可以知道，Pde2對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平是必不可少的，PDE2基因缺失后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP無(wú)法降解以及PKA途徑的持續(xù)性激活。

4 PKA和Bcy1

PKA又稱cAMP依賴的蛋白激酶A，它的激活依賴于cAMP，當(dāng)cAMP水平升高后，與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合從而改變構(gòu)象釋放出催化亞基而激活PKA。白念珠菌中PKA的調(diào)節(jié)亞基由BCY1編碼，催化亞基分別由TPK1和TPK2編碼[25]。

在TPK2基因缺失后，細(xì)胞內(nèi)的PKA活性顯著下降，只有野生型的10%，說(shuō)明PKA的活性主要由Tpk2發(fā)揮[26]。但是，Tpk1在白念珠菌細(xì)胞壁成分的調(diào)控中發(fā)揮著更重要的作用[27]。在TPK2缺失菌中，液體培養(yǎng)基菌絲的生長(zhǎng)顯著受阻而在固體培養(yǎng)基中菌絲形成的影響較小，菌株的毒力也部分下降，反之TPK2的過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)菌絲的生成并且促進(jìn)瓊脂侵襲[28]；與TPK2缺失菌相反，TPK1缺失菌在固體培養(yǎng)基中表現(xiàn)出菌絲生長(zhǎng)的缺陷，而在液體培養(yǎng)基中菌絲形成只受到了輕微的影響[29]，造成這些差異的原因是兩者的N-末端結(jié)構(gòu)域的不同，在N-末端它們大約有80～90個(gè)氨基酸的組成不同，Tpk的N-末端結(jié)構(gòu)域雜交實(shí)驗(yàn)表明瓊脂的侵襲是由Tpk2的N-末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的，但是Tpk1和Tpk2的催化域是高度同源的。

由于BCY1純合子缺失菌不能存活，所以Cassola等構(gòu)建了BCY1TPK2雜合缺失菌，缺失菌在GlcNac和血清誘導(dǎo)的條件下存在出芽缺陷。另外，通過(guò)Tpk1-GFP考察了野生菌、TPK2缺失菌和BCY1TPK2缺失菌細(xì)胞中Tpk1的定位，發(fā)現(xiàn)與野生菌、TPK2缺失菌中，Tpk1主要定位于細(xì)胞核中不同的是BCY1TPK2缺失菌中Tpk1分散于整個(gè)細(xì)胞中。另外，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Bcy1與Tpk1-GFP有直接作用，說(shuō)明Bcy1可能在PKA的催化亞基的細(xì)胞核定位中發(fā)揮重要的功能[30]。

5 Efg1和Flo8

多項(xiàng)證據(jù)表明Efg1是PKA的下游元件，TPK2的過(guò)表達(dá)不能恢復(fù)EFG1缺失菌的表型，而EFG1的過(guò)表達(dá)卻能夠回復(fù)TPK2基因缺失的菌絲生長(zhǎng)缺陷；此外血清誘導(dǎo)的形態(tài)轉(zhuǎn)換已知是由PKA途徑介導(dǎo)的，而EFG1在這個(gè)過(guò)程中是不可或缺的[31-32]。Efg1作為該通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)下游多種基因的表達(dá)，從而調(diào)控白念珠菌中菌絲形成、生物被膜生成等多種生物學(xué)功能。

Efg1是真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子APSES (Asm1,Phd1,Sok2,Efg1,StuA)家族的成員，在形態(tài)轉(zhuǎn)換以及能量代謝等許多不同的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[33]。APSES家族還包括構(gòu)巢曲霉的StuA和粗糙脈孢菌中的Asm1，以及釀酒酵母中的Phd1和Sok2，所有APSES蛋白共享約100個(gè)氨基酸的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (APSES結(jié)構(gòu)域)，其中心結(jié)構(gòu)域?yàn)榈湫偷膲A性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH)結(jié)構(gòu)[34]，在白念珠菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種APSES蛋白：Efg1和Efh1。

Efg1中央是堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH)結(jié)構(gòu)域，其側(cè)翼是在真菌APSES蛋白中高度保守的序列，在N-和C-末端有多聚谷氨酰胺的延伸。Efg1的APSES域是真菌菌絲形態(tài)發(fā)生中必需的，而bHLH側(cè)翼序列是維持Efg1穩(wěn)定所必不可少的。Flo8轉(zhuǎn)錄因子與Efg1的結(jié)合不依賴于APSES結(jié)構(gòu)域，而Efg1與MluI細(xì)胞周期盒 (MCB)元件結(jié)合僅需要APSES結(jié)構(gòu)域。這表明Efg1的功能域包括參與DNA結(jié)合的APSES結(jié)構(gòu)域，以及同各種蛋白質(zhì)相互作用和調(diào)節(jié)活性所需的側(cè)翼區(qū)[35]。

EFG1缺失菌在許多誘導(dǎo)條件下菌絲生長(zhǎng)缺陷[36]，在液體或固體培養(yǎng)基中添加血清或GlcNAc誘導(dǎo)菌絲形成被完全阻斷，相比之下，在微需氧或包埋條件下，EFG1基因缺失菌菌絲形成不受影響，甚至可能促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)[37]。這些結(jié)果表明，在不同的條件下，Efg1既可以發(fā)揮促進(jìn)菌絲形成的作用，也能抑制這一過(guò)程。

Efg1的DNA結(jié)合域可以與菌絲特異基因HYR1、HGC1和ECE1等相結(jié)合，并且介導(dǎo)它們與菌絲特異性Swi/Snf復(fù)合物的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)靶基因在菌絲生成期間的轉(zhuǎn)錄激活[38]。另外，Efg1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁相關(guān)蛋白基因 (如HWP1、ALS3)的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面特性。Hwp1在白念珠菌細(xì)胞間相互作用以及生物膜形成中十分重要的，在白念珠菌黏附于上皮細(xì)胞的過(guò)程中也是必不可少的[39]；Als3是白念珠菌黏附到多種宿主細(xì)胞表面蛋白所必需的，包括內(nèi)皮細(xì)胞上的N-鈣粘蛋白和口腔上皮細(xì)胞上的E-鈣粘蛋白[40]。Efg1還參與了白念珠菌的代謝，在糖酵解中發(fā)揮著作用，在EFG1缺失菌中，糖酵解相關(guān)基因如FBA1、PFK1和ENO1等轉(zhuǎn)錄水平下降[41]。Efg1還負(fù)責(zé)調(diào)控天冬氨酸蛋白酶家族SAP3、SAP5等的表達(dá)，在EFG1缺失菌中，SAP3和SAP5表達(dá)量明顯降低，菌株毒力下降[42]，天冬氨酸蛋白酶是白念珠菌分泌的關(guān)鍵毒力因子，表明Ras/cAMP/PKA信號(hào)通路在毒力因子的控制中也發(fā)揮著重要的作用。

Flo8是一個(gè)含有LisH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，是RAS/cAMP/PKA通路下游的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)影響白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換從而影響其致病性和毒力[43-44]，在生物被膜的形成中也發(fā)揮重要的作用[45]。

白念珠菌中FLO8的缺失完全阻斷菌絲形成和菌絲相關(guān)基因的表達(dá)，并導(dǎo)致系統(tǒng)性念珠菌病模型中毒力的喪失。FLO8和EFG1缺失菌的全基因組轉(zhuǎn)錄分析表明，F(xiàn)lo8特異性調(diào)節(jié)Efg1調(diào)節(jié)基因的子集，主要是菌絲特異性基因，提示Flo8可能在Efg1的下游發(fā)生作用，另外免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明Flo8與Efg1有直接的相互作用，這些結(jié)果提示我們Efg1/Flo8復(fù)合物可能調(diào)控著眾多RAS/cAMP/PKA通路相關(guān)基因的表達(dá)，如HWP1、HYR1、ECE1、ALS3、IHD1、SAP5和HGC1等[46]。此外，Du等[47]的研究表明Flo8在CO2誘導(dǎo)的灰白轉(zhuǎn)換以及菌絲生長(zhǎng)中扮演著關(guān)鍵的角色，并且Flo8的異位表達(dá)能夠顯著提高白念珠菌對(duì)CO2的敏感性。

RAS/cAMP/PKA信號(hào)通路在白念珠菌中發(fā)揮著十分廣泛且重要的作用，在白念珠菌的生存以及對(duì)宿主的感染中都扮演著舉足輕重的角色，對(duì)于形態(tài)轉(zhuǎn)換、黏附、侵襲、代謝、耐藥、應(yīng)激反應(yīng)和毒力都是不可或缺的。該通路還有許多新的未知功能的基因等待著被發(fā)掘研究，對(duì)這些基因功能的探索將會(huì)幫助我們了解RAS/cAMP/PKA通路的調(diào)控及分子機(jī)制。隨著白念珠菌中一些重要的毒力因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被闡釋清楚，其中一些基因或者蛋白未來(lái)或許能夠成為研發(fā)新的抗真菌藥物的靶點(diǎn)。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

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魯仁義，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:15821695738@163.com

姜遠(yuǎn)英,E-mail:13761571578@163.com;閻瀾,E-mail:ylan20001228@sina.com

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1673-3827(2017)12-0052-06

2017-01-12