席玲玲，蔡 旻，王新霞，汪以真 *

（浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部動物營養(yǎng)與飼料重點開放實驗室，浙江省動物飼料與營養(yǎng)重點實驗室，浙江杭州 310058）

不同脂肪酸對體外培養(yǎng)豬肌管細胞脂質(zhì)代謝的影響

席玲玲，蔡 旻，王新霞，汪以真 *

（浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部動物營養(yǎng)與飼料重點開放實驗室，浙江省動物飼料與營養(yǎng)重點實驗室，浙江杭州 310058）

本研究旨在探究日糧中不同飽和度脂肪酸棕櫚酸、油酸、亞油酸在體外培養(yǎng)的豬肌管細胞內(nèi)的代謝和沉積差異。體外分離培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細胞后，誘導(dǎo)成肌分化，分別用100 μmol/L普通和[1-14C]標記棕櫚酸、油酸、亞油酸孵育豬肌管細胞24 h后，細胞甘油三酯測定、同位素示蹤法跟蹤3種脂肪酸的代謝過程，實時熒光定量和Western blot檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白的表達。結(jié)果表明：亞油酸組細胞中甘油三酯沉積量最高（P＜0.05）；同位素示蹤法發(fā)現(xiàn)亞油酸在細胞中的氧化量和攝取量均最高（P＜0.05），且在細胞甘油三酯中的沉積量最高（P＜0.05）；亞油酸能夠顯著提高肌管細胞脂肪酸攝取相關(guān)基因CD36、FABP4、FATP1，脂肪酸氧化相關(guān)基因CPT1、CytC、AMPKα2的表達（P＜0.05），以及線粒體功能相關(guān)蛋白NRF1表達，并能夠顯著促進甘油三酯合成相關(guān)基因DGAT2、FAS的表達（P＜0.05）。相比于飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，多不飽和脂肪酸亞油酸能夠促進豬肌管細胞脂肪沉積，并能促進肌管細胞脂肪酸攝取、氧化、甘油三酯合成及促進相關(guān)基因表達。

脂肪酸；豬肌管細胞；脂肪酸代謝；脂肪沉積

豬肉風(fēng)味是豬肉品質(zhì)的重要組成部分，日糧脂肪酸組成可以影響豬骨骼肌細胞膜和細胞內(nèi)的脂肪酸組成從而影響豬肉風(fēng)味[1-2]。骨骼肌細胞內(nèi)甘油三酯沉積與日常飲食和日糧中的脂肪酸種類密切相關(guān)[3-4]。研究日糧不同脂肪酸對骨骼肌肌管細胞脂質(zhì)代謝的影響，可以為日糧脂肪酸改善豬肉風(fēng)味提供理論依據(jù)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，不同碳鏈長度、飽和程度的脂肪酸有著不同的氧化速率[5]。而且不同飽和程度的脂肪酸在不同組織和細胞中的代謝也存在差異。誘導(dǎo)成肌分化的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞可作為研究豬骨骼肌代謝的體外模型。本研究利用同位素示蹤法跟蹤脂肪酸在豬肌管細胞中的代謝過程，并通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡的方法檢測該細胞脂肪酸代謝途徑中關(guān)鍵分子的基因和蛋白表達，揭示日糧不同脂肪酸對豬肌管細胞脂質(zhì)代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 3～5日齡杜×長×大三元雜交健康新生仔豬（科強生態(tài)養(yǎng)殖有限公司）。

1.2 骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)、成肌誘導(dǎo)分化無菌條件下分離仔豬背最長肌，剔除筋膜后用PBS清洗3遍，手術(shù)剪剪碎，肉塊懸浮液用移液管吹成糊狀后加入1 g/L鏈霉蛋白酶（Sigma公司，美國），37℃消化60 min。150目和200目尼龍紗網(wǎng)過濾，

1 250 r/min離心10 min，棄上清，底部細胞用含15% 胎牛血清（Gibco公司，南美）、25 IU青霉素、25 mg/L鏈霉素、1 mg/L BFGF（PeproTech公司，美國）的DMEM/F12（Gibco公司，美國）的完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4 h后上清轉(zhuǎn)移至I型鼠尾膠包被的10 cm細胞培養(yǎng)皿，3 d后換液，得到細胞即為豬骨骼肌衛(wèi)星細胞。當細胞長至80%～90%密度時，用含2%馬血清（Gibco公司，美國）的DMEM/F12（誘導(dǎo)培養(yǎng)基）誘導(dǎo)成肌分化。誘導(dǎo)7 d后，分別用含100 μmol/L棕櫚酸（PA）、油酸（OA）、亞油酸（LA）的DMEM/F12培養(yǎng)基孵育24 h后進行下述試驗。

1.3 油紅O染色 參照Wang等[6]的方法，倒置顯微鏡拍照。

1.4 細胞中甘油三酯含量測定 采用EnzyChromTMTriglyceride Assay Kit試劑盒（BioAssay Systems公司，美國）測定，細胞蛋白濃度校正，每個處理4個重復(fù)， SPASS軟件分析后，Graphpad prism 5軟件作圖。

1.5 同位素示蹤脂質(zhì)代謝試驗 分化成熟的肌管用100 μmol/L [1-14C] PA、[1-14C] OA和[1-14C] LA 37℃孵育24 h。對CO2、ASP、細胞放射性、細胞總脂質(zhì)含量及細胞脂質(zhì)類型進行相對定量測定，從而計算得到細胞脂肪酸攝取、氧化、細胞脂質(zhì)、脂質(zhì)分類。孵育完成后取培養(yǎng)基于10 000 r/min離心10 min，收集上清冰上保存。細胞用冷PBS沖洗3遍，吸干PBS后各加入1 mL甲醇，細胞刮刮下至1.5 mL離心管，收集好的細胞-20℃保存。

脂肪酸氧化測定的方法參照Christiansen等[7]方法并做了調(diào)整。CO2測定：選擇帶塞錐形瓶，瓶塞連接塑料勺，塑料勺內(nèi)放折疊好的濾紙。塑料勺內(nèi)加入0.3 mL苯乙胺、甲醇1∶1混合液；取1.5 mL培養(yǎng)基于錐形瓶后，往錐形瓶中加入0.3 mL 1 mol/L的HClO4。所有試劑添加完成后，立即蓋上瓶塞，室溫孵育60 min。剪下塑料勺，放入測定管，加入5 mL閃爍液，液閃儀分析。ASP測定：取0.4 mL培養(yǎng)基于1.5 mL離心管，加入0.2 mL 2 mol/L HClO4，冰上孵育60 min 后，10 000 r/min離心10 min，取上清用于閃爍分析。

細胞脂肪酸攝取分析：取50 μL細胞懸液用液閃儀測定細胞放射性。細胞脂肪酸攝取為細胞放射性和脂肪酸氧化量數(shù)據(jù)換算后之和。

細胞脂質(zhì)分離和脂質(zhì)種類分析：細胞內(nèi)總脂質(zhì)分離參考Folch等[8]的方法。取一半用于液閃儀檢測細胞總脂質(zhì)含量。剩余的脂質(zhì)用氮吹儀吹干后加入100 μL氯仿重新溶解。通過高效薄層層析色譜法分離游離脂肪酸（FFA）、甘油三酯（TAG）、甘油二酯（DAG）、磷脂（PL）和膽固醇酯（CE），流動相為己烷、乙醚、乙酸（(85∶15∶1）。將細胞脂質(zhì)點到層析板，流動相距頂部1.5 cm時，取出層析板并于通風(fēng)廚晾干。3%醋酸銅的磷酸溶液（8%磷酸水溶液）顯色，每種脂質(zhì)在層析板上形成一個點，剪下各個點用于閃爍分析。

表1 實時熒光定量 PCR 引物

1.6 實時熒光定量PCR Trizol法（新景生物科技公司，杭州）提取細胞總RNA，NanoDrop 2000（Thermo Fisher，美國）測定濃度后反轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR測定使用ABI Step-One PlusTM系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國），參照文獻[9]中的方法。cDNA1∶10稀釋后采用10 μL PCR體系：4 μL cDNA，5 μL SYBR Green Master（Roche Applied Science，瑞士），0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物。2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，并以18 S為內(nèi)參。引物序列詳見表1。

1.7 蛋白免疫印跡方法 參照文獻[9]，NRF1單克隆抗體購自Abcam公司（Abcam，英國）。

1.8 統(tǒng)計分析 用SPSS 16.0（SPSS Inc.，美國）進行數(shù)據(jù)分析，采用One-Way ANOVA顯著性分析，并用t檢驗（Student's t test）法進行統(tǒng)計。

圖1A 不同脂肪酸孵育豬肌管細胞后油紅O染色

2 結(jié) 果

2.1 不同脂肪酸引起體外培養(yǎng)豬肌管細胞甘油三酯沉積差異 100 μmol/L PA、OA、LA 孵育誘導(dǎo)成熟豬肌管細胞24 h，油紅O染色后拍照，并用甘油三酯測定試劑盒定量測定細胞內(nèi)甘油三酯含量。如圖1A和圖1B所示，體外試驗證明細胞外脂肪酸可以顯著增加細胞內(nèi)甘油三酯沉積量，LA孵育后細胞內(nèi)甘油三酯的沉積量顯著高于PA和OA處理組。

圖1B 不同脂肪酸孵育豬肌管細胞甘油三酯含量

2.2 同位素示蹤法跟蹤不同脂肪酸在體外培養(yǎng)豬肌管細胞中的代謝差異 分別用[1-14C] 標記的PA、OA和LA孵育誘導(dǎo)成熟的豬肌管細胞，用于跟蹤脂肪酸的攝取、氧化和酯化過程。試驗分別測定了細胞脂質(zhì)、β氧化產(chǎn)物（CO2+ASP）、全細胞放射性、不同脂質(zhì)成分的放射性。肌細胞對OA、LA的攝取和氧化均顯著高于PA（P＜0.05），對LA的氧化顯著高于OA（P＜0.05）。細胞總的脂質(zhì)含量未出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。甘油三酯分別占[1-14C] PA、OA、LA放 射 性 的61.36%、64.36%和67.49%；磷脂分別占[1-14C] PA、OA、LA放射性的34.58%、29.28%和20.65%。

2.3 不同脂肪酸孵育引起體外培養(yǎng)豬肌管細胞脂肪酸攝取相關(guān)基因的表達差異 24 h脂肪酸孵育后，實時熒光定量測定脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因CD36、FABP4、FATP1、FATP4和ACSL的mRNA表達量，并以18 S為內(nèi)參。如圖3所示，相對PA和OA，LA孵育能夠顯著提高CD36、FABP4和FATP1基因mRNA表達量（P＜0.05）。OA孵育后，CD36 mRNA表達量顯著高于PA（P＜0.05）。OA、LA能夠提高ACSL的mRNA表達量，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同脂肪酸孵育引起體外培養(yǎng)豬肌管細胞脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達差異 熒光定量測定了脂肪酸β氧化及線粒體相關(guān)基因蛋白的表達。由圖4可見，β氧化關(guān)鍵基因CPT1的表達量OA和LA組顯著高于PA組（P＜0.05）。表征線粒體活性的基因細胞色素C即CytC的mRNA表達量顯著高于PA和OA組（P＜0.05）。其他β氧化相關(guān)通路基因呈現(xiàn)出相似趨勢，AMPKα2和PPARα的mRNA表達量LA組顯著高于PA和OA組（P＜0.05）。NRF1即線粒體核呼吸鏈因子，其表達量能夠體現(xiàn)線粒體功能。LA處理組的NRF1顯著提高（P＜0.05）。

2.5 不同脂肪酸孵育引起體外培養(yǎng)豬肌管細胞甘油三酯代謝相關(guān)基因的表達差異 細胞甘油三酯的沉積量是細胞甘油三酯合成和分解途徑共同作用的結(jié)果，即合成關(guān)鍵基因DGAT和FAS，甘油三酯分解關(guān)鍵基因ATGL。圖5結(jié)果表示，LA能夠顯著促進合成相關(guān)基因DGAT、FAS的mRNA表達水平（P＜0.05），而PA、OA、LA孵育后分解關(guān)鍵基因ATGL的mRNA表達量無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 同位素示蹤法脂肪酸代謝差異

圖3 脂肪酸攝取相關(guān)基因表達

圖4 脂肪酸氧化相關(guān)基因蛋白表達

3 討 論

3.1 體外試驗中不同脂肪酸引起體外培養(yǎng)豬肌管細胞甘油三酯的沉積差異 本研究發(fā)現(xiàn)，不同脂肪酸體外孵育能夠引起細胞內(nèi)的甘油三酯沉積量不同程度的增加。LA處理后，甘油三酯沉積量顯著高于PA和OA組，而PA與OA組差異并不顯著，這與其在人肌細胞上的結(jié)果不同[10]。骨骼肌承擔了體內(nèi)80%以上的糖負荷，肌細胞內(nèi)過度的甘油三酯沉積又稱脂肪異位沉積，是引起機體胰島素抵抗的重要原因[11]。多項研究證明，n-3多不飽和脂肪酸處理后骨骼肌細胞內(nèi)的甘油三酯沉積量顯著低于其他脂肪酸組[12]。LA作為常見的n-6多不飽和脂肪酸，反而能夠增加豬肌管細胞甘油三酯的沉積量，為n-6多不飽和脂肪酸在豬肌肉細胞內(nèi)的代謝沉積規(guī)律提供理論依據(jù)。

圖5 甘油三酯代謝相關(guān)基因表達

3.2 不同脂肪酸在體外培養(yǎng)豬肌管細胞脂肪酸的代謝差異 采用[1-14C]同位素示蹤的方法，跟蹤PA、OA、LA在體外培養(yǎng)肌管細胞內(nèi)的代謝過程發(fā)現(xiàn)，LA的攝取和氧化量顯著高于PA和OA，但在細胞總體脂質(zhì)的沉積方面，3種脂肪酸并無顯著差異。然而3種脂肪酸在不同的脂質(zhì)分配上發(fā)生了較大差異，PA在磷脂中的沉積量最高，而LA主要以甘油三酯的形式儲存在細胞內(nèi)，而且在甘油二酯和游離脂肪酸的含量最高，表明不同脂肪酸的結(jié)構(gòu)影響了整個肌管細胞脂肪酸代謝，包括脂肪酸的攝取、氧化、游離脂肪酸酯化（甘油三酯、磷脂、膽固醇）等代謝過程。游離脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、磷脂和膽固醇酯每種細胞內(nèi)的脂質(zhì)的脂肪酸組成都對細胞有著重要的影響。磷脂的主要存在形式是胞膜磷脂，胞膜磷脂能影響細胞膜脂肪氧化特性和細胞膜流動性等，從而影響肉色等肉質(zhì)綜合指標。在正常細胞中n-6多不飽和脂肪酸主要以磷脂的形式存在，而飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸主要以中性脂質(zhì)的形式存在[13]。當細胞外脂肪酸處理時，不同脂肪酸以與正常情況下相反的方式酯化進入不同的細胞脂質(zhì)。與其他2種脂肪酸相比，LA在甘油三酯、PA在磷脂中的沉積量最大。

3.3 不同脂肪酸影響體外培養(yǎng)豬肌管細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的蛋白表達 不同的胞外脂肪酸對體外培養(yǎng)豬肌管細胞脂肪酸代謝過程關(guān)鍵基因影響不同。機體的很大部分能量從長鏈脂肪酸獲取，研究指出當細胞脂肪酸攝取量增加時，相應(yīng)的轉(zhuǎn)運蛋白的表達量會隨之升高。本研究證明，3種脂肪酸孵育后轉(zhuǎn)運相關(guān)基因中CD36表達量變化最大，在氧化相關(guān)蛋白中線粒體相關(guān)基因CPT1和CytC的mRNA表達量差異顯著，且氧化相關(guān)通路基因AMPKα2和PPARα差異顯著，同時合成相關(guān)基因DGAT和FAS的mRNA表達量差異顯著。這些基因都與AMPK通路關(guān)系密切，提示AMPK是細胞內(nèi)重要的能量調(diào)節(jié)器，也可能是不同脂肪酸影響細胞脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵。

4 結(jié) 論

PA、OA、LA孵育體外培養(yǎng)豬肌管細胞在各脂肪酸代謝過程存在差異，LA能夠促進豬肌管細胞攝取量和β氧化關(guān)鍵基因表達，并能夠提高線粒體活性，且LA攝取和氧化量均顯著高于其他2種脂肪酸，并能促進細胞甘油三酯合成使其更多地以甘油三酯的形式儲存在細胞中。

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E ff ects of Fatty Acids on Lipid Metabolism in Porcine Skeletal Myotubes

XI Ling-ling, CAI Min, WANG Xin-xia, WANG Yi-zhen*
(College of Animal Sciences, Zhejiang University; Key Laboratory of Animal Nutrition & Feed Sciences, Ministry of Agriculture; Zhejiang Provincial Laboratory of Feed and Animal Nutrition; Zhejiang Hangzhou 310058, China)

This study was conducted to investigate di ff erent e ff ects of the dietary fatty acids with di ff erent saturation, oleic acid and linoleic acid on lipids metabolism and accumulation in cultured porcine skeletal myotubes. Skeletal muscle satellite cells were isolated, and induce into myotubes, myotubes were incubation with normal and [1-14C] labeled 100 μmol/L palmitic acid, oleic acid and linoleic acid respectively. To investigate the e ff ects of di ff erent fatty acids on lipid metabolism in porcine skeletal muscle myotubes, cell triglyceride was determined and lipid metabolism was detected by isotope tracing method, lipid metabolism related genes and protein were investigated by real-time fluorescence quantitative assay and western blot. As a result, myotubes treated with linoleic acid had the most amount of triglyceride accumulation (P＜0.05). The result of tracing method showed that linoleic acid had the highest oxidation and uptake rate in myotubes ( P＜0.05), also with most triglyceride accumulation (P＜0.05). Linoleic acid can promote the mRNA expression of genes related to fatty acid uptake(CD36, FABP4, FATP1), fatty acid oxidation(CPT1, CytC, AMPKα2)and triglyceride synthesis(DGAT2, FAS) (P ＜0.05). Linoleic acid also improved mitochondrial function related protein NRF1 synthesis in porcine skeletal muscle myotubes. It concluded that polyunsaturated fatty acids linoleic acid can promote the fat deposition of pig skeletal myotubes and promote fatty acid uptake, oxidation, triglyceride synthesis and the promotion of related genes in myotubes compared to saturated and monounsaturated fatty acids.

Fatty acids; Porcine skeletal myotubes; Lipid accumulation;Lipid metabolism

S828.5

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-058

2016-10-09；

2016-12-27

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2012 CB1247）

席玲玲（1990-），女，河北人，碩士研究生，主要從事動物營養(yǎng)與肉品質(zhì)研究，E-mail: summeryXi@163.com

* 通訊作者：汪以真，E-mail: yzwang321@zju.edu.cn