金 梅，王 瑞，王 婧，樸 君，樸敬愛，趙鳳琴

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116081）

HGT KAPs基因家族在遼寧絨山羊皮膚毛囊中的表達(dá)研究

金 梅，王 瑞，王 婧，樸 君，樸敬愛，趙鳳琴*

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116081）

為進(jìn)一步探索高甘氨酸/酪氨酸角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因家族（HGT KAPs）與遼寧絨山羊羊絨品質(zhì)——絨毛纖維直徑的關(guān)系，本研究運(yùn)用半定量RT-PCR檢測KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1和KAP8.2在皮膚及各組織中的表達(dá)，通過原位雜交對其進(jìn)行定位分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測興盛期、退行期基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明：5個(gè)基因特異地表達(dá)于皮膚，在初、次級毛囊的皮質(zhì)層、內(nèi)根鞘中有明顯的表達(dá)信號。KAP6-1.2和KAP8.1在興盛期初次級毛囊的表達(dá)量差異不顯著，KAP6.2在興盛期、退行期初級毛囊的表達(dá)量均高于次級毛囊，而KAP7.1、KAP8.2在興盛期次級毛囊的表達(dá)量高于初級毛囊，而退行期與之相反。因此推測，HGT KAPs基因家族在調(diào)控遼寧絨山羊絨毛纖維直徑方面具有重要的作用，是編碼羊絨結(jié)構(gòu)蛋白的基因。

遼寧絨山羊；HGT KAPs基因；RT-PCR；原位雜交；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

遼寧絨山羊原產(chǎn)于遼寧省遼東半島，屬高產(chǎn)型絨山羊。絨山羊毛主要由絨和毛2種纖維組成，與之相應(yīng)的皮膚毛囊也分為2類：生長毛的稱為初級毛囊，生長絨的稱為次級毛囊。毛囊的生長發(fā)育貫穿一生，呈周期性變化，一年內(nèi)分別經(jīng)歷生長期、興盛期、退行期，最后進(jìn)入休止期。次級毛囊由初級毛囊分化而來，但羊絨較羊毛具有輕柔、光滑、細(xì)軟等優(yōu)點(diǎn)使得二者產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益大不相同。羊毛和羊絨主要由角蛋白中間絲蛋白和角蛋白結(jié)合蛋白（KAP）構(gòu)成，前者位于羊毛中間構(gòu)成骨架，后者作為基質(zhì)填充物并與前者交叉連接[1]。KAP是毛發(fā)成分的重要結(jié)構(gòu)蛋白，其含量和結(jié)構(gòu)成分直接影響著毛發(fā)的物理特性[2]。其中，高甘氨酸/酪氨酸KAP（HGT）是羊毛中最小的角蛋白，HGT有助于增加毛纖維機(jī)械強(qiáng)度和促進(jìn)毛發(fā)的形成[3]。Matsunaqa等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HGT KAPs對毛發(fā)的機(jī)械強(qiáng)度及羊毛品質(zhì)具有一定的影響。因此，從毛囊中各種角蛋白及角蛋白基因的表達(dá)入手，找出其中差異，是實(shí)現(xiàn)控制絨品質(zhì)的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)以遼寧絨山羊?yàn)檠芯繉ο?，選取高甘氨酸/酪氨酸KAP家族KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2為候選基因，通過定量、半定量RT-PCR，以及原位雜交技術(shù)對其在初、次級毛囊中的表達(dá)差異進(jìn)行研究。通過進(jìn)一步研究HGT KAPs基因家族表達(dá)水平與絨毛直徑的關(guān)聯(lián)分析，旨在從分子水平上了解KAP家族對絨毛生長的調(diào)控機(jī)制，為今后絨山羊育種提供一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)以及可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 實(shí)驗(yàn)羊6只，公、母各3只。在10月中旬絨山羊毛囊生長期，取其心、肝、脾、肺、腎、皮膚組織，于1月中旬毛囊退行期和3月中旬毛囊休止期，分別選取體側(cè)部皮膚組織。

1.2 初、次級毛囊的分離 利用采集毛囊生長期及退行期的皮膚組織，在真皮與皮下脂肪的交界處剪開，剪掉皮下脂肪組織，順著毛囊方向?qū)⒚遗c周圍組織鈍性分離，挑選完整無損的毛囊放于組織保護(hù)液中備用。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 使用Trizol（TaKaRa公司）試劑分別提取毛囊生長期和退行期初、次級毛囊總RNA以及休止期皮膚總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照RT-PCR（TaKaRa公司）試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 半定量RT-PCR反應(yīng) 利用半定量RTPCR對KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2在皮膚、心、肝、脾、肺、腎中的表達(dá)進(jìn)行分析，以ACTB表達(dá)水平作為均一化的內(nèi)參。根據(jù)GenBank提供的序列（AY310750、AY316158、AY510121、AY510122、AY510123、AF481159）設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行合成（表1）。反應(yīng)體系為25 μL，其中2×Master Mix 12.5 μL，Primer F/R（10 μmol/L）各1 μL，RT產(chǎn)物2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸 7 min。

1.5 原位雜交 提取成年遼寧絨山羊體側(cè)皮膚，石蠟包埋，DEPC水中展開，37℃烘烤過夜備用。將上述RT-PCR產(chǎn)物克隆測序后，經(jīng)反復(fù)純化作為制作地高辛標(biāo)記探針的模板，依照Roche公司的地高辛標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行。組織切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、蛋白酶消化并沖洗干燥后，在2×SSC濕盒內(nèi)42℃預(yù)雜交1 h，42℃雜交18 h，經(jīng)梯度SSC處理后，NBT/BCIP顯色16 h，滅菌水終止顯色，伊紅復(fù)染，脫水后中性樹膠封片，顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 以ACTB表達(dá)水平作為均一化的內(nèi)參，對毛囊生長期和退行期進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。根據(jù)GenBank提供的序列（AY510121、AY510123）設(shè)計(jì)KAP7.1、KAP8.2引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成（表1）。反應(yīng)體系為20 μL： SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，Primer F/R各0.4 μL，RT產(chǎn)物1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，共40個(gè)PCR 循環(huán)。試驗(yàn)中先在普通PCR上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，包括退火溫度和引物濃度等。每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA提取 電泳結(jié)果顯示，從毛囊生長期、退行期的初、次級毛囊及休止期皮膚中提取出的總RNA較完整（圖1）。OD值顯示，毛囊生長期、退行期初次級毛囊中總RNA純度較好，A260/A280約2.0左右。

2.2 半定量RT-PCR表達(dá)譜分析 通過半定量RT-PCR檢 測KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2在心、肝、脾、肺、腎中表達(dá)情況。結(jié)果顯示，沒有檢測到基因的表達(dá)（圖2）。用半定量RT-PCR分別檢測KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2在皮膚組織中表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在皮膚組織中檢測到基因的表達(dá)（圖3）。

2.3 原位雜交 在顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅棕色的雜交信號，原位雜交結(jié)果為陽性。結(jié)果顯示，5個(gè)基因在初、次級毛囊均有強(qiáng)烈表達(dá)，在內(nèi)根鞘中檢測到明顯的表達(dá)信號。但在初、次級毛囊的毛乳頭、外根鞘、皮脂腺以及對照組中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)信號。

KAP6-1.2在初級毛囊的皮質(zhì)層中存在不對稱表達(dá)（圖4-A、D）。在次級毛囊的皮質(zhì)層的上部檢測到了表達(dá)信號（圖4-B、C）。KAP6.2在初級毛囊的皮質(zhì)層中存在不對稱表達(dá)（圖5-A）。在次級毛囊皮質(zhì)層的中上部有明顯的表達(dá)（圖5-C、E）。KAP7.1在初級毛囊的皮質(zhì)層中存在不對稱表達(dá)（圖6-A、B）且KAP7.1在初、次級毛囊的毛母質(zhì)中也有明顯的表達(dá)信號（圖6-A、B、C、D）。KAP8.1在初級毛囊皮質(zhì)層中存在對稱及不對稱表達(dá)（圖7-A、B）且在毛球彎曲處里面檢測到微弱的表達(dá)信

表1 引物序列

圖1 毛囊總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2在各組織中的表達(dá)

圖3 KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2在皮膚組織中的表達(dá)

圖4 KAP6-1.2基因在遼寧絨山羊毛囊中的表達(dá)

圖5 KAP6.2基因在遼寧絨山羊毛囊中的表達(dá)

圖6 KAP7.1基因在遼寧絨山羊毛囊中的表達(dá)

圖7 KAP8.1基因在遼寧絨山羊毛囊中的表達(dá)

號（圖7-C、D）。此外，KAP8.1還在初級毛囊髓質(zhì)中檢測到微弱的表達(dá)信號。KAP8.1在次級毛囊皮質(zhì)層中上部檢測到明顯的表達(dá)信號（圖7-C、D）。KAP8.2在初級毛囊皮質(zhì)層中存在不對稱表達(dá)（圖8、9），在次級毛囊皮質(zhì)層的上中部檢測到明顯的表達(dá)信號（圖8-C、D）。

圖8 KAP8.2基因在遼寧絨山羊毛囊中的表達(dá)

圖9 遼寧絨山羊毛囊原位雜交對照組

2.4 熒光定量RT-PCR進(jìn)行表達(dá)差異分析 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，R2＞0.98，可在寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。擴(kuò)增效率較好，0.8＜E＜1.2。對5個(gè)基因及休止期皮膚的內(nèi)參基因（ATCB）進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，都得到了較好的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，擴(kuò)增效率較高，且熔解曲線峰形單一，說明反應(yīng)特異性好。

圖10 興盛期相對定量柱形圖

圖11 退行期相對定量柱形圖

毛囊生長期，KAP7.1在次級毛囊中的表達(dá)量是初級毛囊的2.28倍（P＜0.01）。KAP8.2在次級毛囊中的表達(dá)量是初級毛囊的2.71倍（P＜0.01）。KAP6.2則恰好相反，在初級毛囊中的表達(dá)量約為次級毛囊的2倍（P＜0.01）。KAP6-1.2、KAP8.1在初、次級毛囊中的表達(dá)差異不明顯（圖10）。毛囊退行期，KAP6.2在初級毛囊中的表達(dá)量約為次級毛囊的1.11倍（P＜0.05）。而KAP7.1、KAP8.2在初、次級毛囊中的表達(dá)趨勢與興盛期相反，KAP7.1、KAP8.2在初級毛囊中的表達(dá)量依次為次級毛囊的1.22倍（P＜0.05）和1.67倍（P＜0.05）（圖11）。毛囊進(jìn)入休止期之后，初、次級毛囊已經(jīng)無法清晰的分辨出來，因此僅檢測了毛囊休止期皮膚中KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2的相對表達(dá)量，其在皮膚中的表達(dá)情況與退行期大致在同一水平。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)旨在研究分析與絨纖維功能相關(guān)的基因的表達(dá)情況，篩選出影響絨毛細(xì)度及羊絨纖維品質(zhì)的基因。通過半定量RT-PCR檢測絨山羊KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2在心、肝、脾、肺、腎及皮膚中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示基因特異表達(dá)于皮膚。

本研究利用原位雜交技術(shù)檢測基因在毛囊中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，5個(gè)基因均在次級毛囊的皮質(zhì)層中上部表達(dá)，與張俊霞等[5]研究的KAP6在內(nèi)蒙古絨山羊皮膚初、次級毛囊的皮質(zhì)層有強(qiáng)烈的表達(dá)信號結(jié)果一致。說明這5個(gè)基因是毛囊皮質(zhì)蛋白的主要結(jié)構(gòu)組分。相關(guān)研究指出，只有高度不對稱表達(dá)的基因，如KRT27、KRT35、KRT85與最初皮質(zhì)層分化和頂毛發(fā)的彎曲度有關(guān)[6]。然而，許多后期不對稱表達(dá)的基因也在直的毛發(fā)纖維中表達(dá)，包括Wiltshire綿羊初級毛囊中表達(dá)的KRT38、KAP6-1.4[5]，及人毛發(fā)中表達(dá)的KAP8.1[7]。本實(shí)驗(yàn)中，由于5個(gè)基因在初級毛囊中存在不對稱表達(dá)，因此推測它們可能參與調(diào)控直的毛發(fā)纖維，對該結(jié)果的證實(shí)還需對結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)基因的作用機(jī)制進(jìn)一步研究。此外，在次級毛囊毛母質(zhì)發(fā)現(xiàn)KAP7.1微弱的表達(dá)信號，說明KAP7.1是次級毛囊毛母質(zhì)的組成成分。目前，大多數(shù)的KAP均被定位于毛囊的皮質(zhì)層或表皮區(qū)域[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因均在毛囊內(nèi)根鞘中表達(dá)，KAP8.1還在初級毛囊髓質(zhì)層中檢測到表達(dá)信號，這與之前的研究報(bào)道存在差異。上述5個(gè)基因原位雜交結(jié)果的不同，證明5個(gè)基因可能與興盛期毛囊內(nèi)根鞘的生長有關(guān)，其中KAP8.1可能與髓質(zhì)層的再生有關(guān)。

目前有超過上百種角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因被分為27個(gè)角蛋白家族，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)相繼被鑒定[9]，而且90%綿羊的毛纖維都是由角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白組成的[10]，KAPs在不同物種或在同一物種不同品種的毛發(fā)中的結(jié)構(gòu)和含量變化較大[11]。因此，為進(jìn)一步研究KAPs對絨毛的調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測5個(gè)基因在毛囊生長期和退行期初、次級毛囊的表達(dá)差異，目的是找到影響羊毛纖維直徑的基因及其表達(dá)方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KAP6-1.2、KAP8.1在興盛期時(shí)初、次級毛囊中的表達(dá)量基本一致，基于此，本實(shí)驗(yàn)未測KAP6-1.2、KAP8.1基因在退行期初次級毛囊的表達(dá)量。并有研究推測綿羊KAP6由多位點(diǎn)組成且存在多態(tài)性[12]。且有Zhou等[13]證明KAP6-1存在多態(tài)性且影響羊毛纖維的直徑。KAP6-1.2是KAP6家族6個(gè)成員之一，與家族其他成員序列的一致性最小，可能是較晚出現(xiàn)的變異[14]。cDNA序列的差異導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的差異，最終導(dǎo)致功能上的差異。KAP8.1屬于高甘氨酸/酪氨酸I型蛋白，與KAP6-1.2不同，是由單一基因編碼，此外，Zhao 等[15]證明KAP8.1具有多態(tài)性，并推測其可能與絨纖維直徑相關(guān)。因此，KAP6-1.2、KAP8.1對羊毛纖維品質(zhì)可能的調(diào)節(jié)功能還有待進(jìn)一步的研究。KAP6.2在毛囊生長期和退行期初級毛囊的表達(dá)量均高于次級毛囊，則證明該基因可能具有抑制絨毛生長。使絨毛變粗的作用。劉桂芬等[16]也證明角蛋白基因與羊毛的產(chǎn)量、品質(zhì)有重要的關(guān)系，并把KAP6.1基因的外顯子作為羊絨細(xì)度的候選基因。KAP7.1和KAP8.2在興盛期次級毛囊中的表達(dá)量分別是初級毛囊的2.28和2.71倍，而在毛囊退行期時(shí)2個(gè)基因在初級毛囊中的表達(dá)量反而比次級毛囊中的多，由此可推斷KAP7.1和KAP8.2參與了絨毛的形成，且在初、次級毛囊中的表達(dá)程度不同，可能對絨毛的細(xì)度具有一定的調(diào)控作用，并且與絨毛周期性變化相關(guān)。這與Gong等[17]推測綿羊KAP8.2在羊毛的形成中起著重要作用的研究結(jié)果一致。

上述結(jié)果表明，這些基因在毛囊生長的不同時(shí)期具有明顯的表達(dá)特征，Keratin及KAPs在調(diào)控絨品質(zhì)上起重要作用，可能是通過KAP-KAP、Keratin-KAP和Keratin-Keratin家族之間的相互作用實(shí)現(xiàn)的，還可能受其他基因的調(diào)控[18]。因而推斷，KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2可能通過相互作用，共同參與調(diào)控毛囊生長的周期性變化，進(jìn)而影響絨細(xì)度，這為今后鑒定更多與絨細(xì)度相關(guān)基因及進(jìn)一步揭示其作用和調(diào)控機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過定量、半定量RT-PCR及原位雜交，對HGT KAPs基因家族KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1、KAP8.2在遼寧絨山羊中的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，5個(gè)基因特異地表達(dá)于皮膚，在初、次級毛囊的皮質(zhì)層、內(nèi)根鞘中有明顯的表達(dá)信號。KAP6.2具有使絨毛變粗的功能，KAP7.1、KAP8.2可能對絨毛生長的粗細(xì)及毛囊周期性變化有著重要的調(diào)控作用。由此推測，HGT KAPs基因家族在調(diào)控遼寧絨山羊絨毛纖維直徑方面具有重要的作用，是編碼羊絨結(jié)構(gòu)蛋白的基因。

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The Expression of Glycine/Tyrosin-rich Keratin-associated Proteins Genes in Hair Follicle of Liaoning Cashmere Goat

JIN Mei, WANG Rui, WANG Jing, PIAO Jun, PIAO Jing-ai, ZHAO Feng-qin*
(Faculty of Life Science, Liaoning Provincial Key Labouratory of Biotechnology and Drug Discovery, Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116081, China)

This experiment was conducted to study the relationship between Glycine/Tyrosin-rich Keratin-associated Proteins Genes (HGT KAPs) and cashmere fi ber quality (cashmere fi ber diameter) of Liaoning cashmere goat. The semiquantitative RT-PCR was used to detect whether genes of KAP6-1.2, KAP6.2, KAP7.1, KAP8.1 and KAP8.2 were expressed in skin and other organs, in situ hybridization was used to detect the genes expression location,the real-time quantitative PCR was used to analyze the relative quantitative of genes during hair follicle anagen and catagen. The results showed that the genes were only present in skin, the relative quantitative of genes had di ff erent result during hair follicle anagen and catagen.In conclusion, HGT KAPs genes play an important role in controlling cashmere fiber diameter of Liaoning cashmere goat.

Liaoning cashmere goats; HGT KAPs genes; RT-PCR; In situ hybridization; Real-time quantitative PCR

S827.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-040

2016-07-13；

2016-09-24

國家自然科學(xué)基金（31172188）；遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（L20144255）；遼寧省特聘教授資助計(jì)劃（2014.1.1-2016.12.31）

金梅（1966-），女，回族，山東禹城人，博士，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail:jm6688210@163.com

* 通訊作者：趙鳳琴（1976-），女，漢族，寧夏銀川人，博士，講師， 研究方向?yàn)榄h(huán)境生態(tài)學(xué)，E-mail: eco-env@163.com