楊佳洪,黃義松,魏好程,何傳波,鄧 婷,熊何健,*

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門(mén) 361021;2.廈門(mén)佰翔空廚食品有限公司,福建廈門(mén) 361006)

海參內(nèi)臟酶解工藝條件的優(yōu)化

楊佳洪1,黃義松2,魏好程1,何傳波1,鄧 婷1,熊何健1,*

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門(mén) 361021;2.廈門(mén)佰翔空廚食品有限公司,福建廈門(mén) 361006)

建立海參內(nèi)臟酶解工藝條件,為海參內(nèi)臟活性物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。以蛋白水解度和清除DPPH自由基為指標(biāo),分析比較了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶對(duì)海參內(nèi)臟的酶解效果及產(chǎn)物的抗氧化活性,篩選出中性蛋白酶為最佳水解酶,以水解度為指標(biāo),通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化海參內(nèi)臟酶解工藝。結(jié)果表明:最優(yōu)酶解條件為:酶添加量2000 U/g,料液比1∶12 g/mL,酶解溫度50 ℃,酶解液pH7.0。在最優(yōu)條件下,比較不同酶解時(shí)間酶解產(chǎn)物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)第10 h時(shí)酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性,清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.26、5.33 mg/mL。中性酶對(duì)海參內(nèi)臟酶解工藝優(yōu)化合理、可行,酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性。

海參內(nèi)臟,酶解,蛋白水解度,抗氧化

海參(Sea cucumber,Holothuians)屬棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)的總稱(chēng)。作為一種傳統(tǒng)的海珍品,海參是重要的海洋食物和藥物資源,深受中國(guó)、日本和韓國(guó)等亞洲國(guó)家消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。海參含有多種生理活性物質(zhì),國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼從中分離出多種功能成分,如海參多糖[2]、海參皂苷[3]、海參蛋白質(zhì)及多肽[4]等,它們具有抗疲勞、抗氧化、降血脂等諸多功能活性[5-6]。

隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高,海參的需求量不斷增加,消費(fèi)市場(chǎng)不斷擴(kuò)大。然而海參內(nèi)臟的加工技術(shù)和綜合利用程度還較低,加工過(guò)程中產(chǎn)生的下腳料——海參內(nèi)臟,常被當(dāng)作廢棄物,尚未得到充分開(kāi)發(fā)利用,直接丟棄會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[7]。劉小芳等[8]研究指出海參內(nèi)臟中含有蛋白質(zhì)、皂苷和多糖等營(yíng)養(yǎng)及活性物質(zhì)。因而,研究海參內(nèi)臟中的營(yíng)養(yǎng)成分的分離制備對(duì)提高海參的綜合利用和保護(hù)環(huán)境都有重要的現(xiàn)實(shí)意義,對(duì)促進(jìn)海參精深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也有重要意義[9]。

本研究以海參內(nèi)臟為原料,以水解度和DPPH自由基清除率為指標(biāo),研究了堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)海參內(nèi)臟水解效果和抗氧化活性的影響,篩選出水解海參內(nèi)臟制備酶解活性產(chǎn)物的最佳用酶為中性蛋白酶,為獲得更好的酶解效果,需進(jìn)行適度酶解。因此通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解條件,為海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物制備和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參內(nèi)臟 新鮮海參內(nèi)臟采自福建霞浦,經(jīng)凍干后,用試樣粉碎機(jī)將其粉碎,過(guò)40目篩,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

中性蛋白酶(酶活力為1.34×105U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力為4.55×104U/g)、堿性蛋白酶(酶活力為1.53×105U/g) 購(gòu)于諾維信生物技術(shù)有限公司;三氟乙酸、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 購(gòu)于Sigma公司;甲醛AR等其余試劑 國(guó)藥分析純。

FA1004型電子天平 上海精科天平;UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯儀器公司;LEAD-2 pH計(jì) 上海奧豪斯儀器有限公司;JDG-0.2T真空凍干機(jī) 蘭州科近真空凍干有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參內(nèi)臟酶解工藝流程 稱(chēng)取適量海參內(nèi)臟粉,按1∶9 g/mL的液料比加入去離子水,在適當(dāng)?shù)暮銣厮≈胁粩鄶嚢?直到達(dá)到蛋白酶最佳酶解溫度后,保溫5 min,用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)至各蛋白酶的最適pH,加入適量蛋白酶,酶解5 h。酶解結(jié)束后,將酶解液放于95～100 ℃加熱15 min鈍化滅酶,再調(diào)節(jié)酶解液pH至中性,4 ℃低溫離心(10000 r/min,15 min),取上清凍干后備用。

1.2.2 蛋白酶的篩選 不同的蛋白酶具有其各自特有的酶切位點(diǎn)[10],在合適的條件下對(duì)蛋白質(zhì)的酶解效果也不一樣,本實(shí)驗(yàn)選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶3種不同的蛋白酶對(duì)海參內(nèi)臟酶解,酶解條件如表1,以水解度和DPPH自由基清除率為指標(biāo),選擇合適的蛋白酶。

表1 海參內(nèi)臟酶解參數(shù)Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis of sea cucumber visceral

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo),固定酶解時(shí)間為5 h,選擇影響酶解反應(yīng)的酶解溫度、pH、料液比和加酶量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),分析各單因素對(duì)水解度的影響。設(shè)定基礎(chǔ)條件為:料液比1∶9 g/mL,pH調(diào)至7.0,加酶量2000 U/g,酶解溫度為50 ℃,改變其中一個(gè)因素,固定其他因素不變。各個(gè)因素變化梯度分別為:pH(6.0,6.5,7.0,7.5和8.0)、酶解溫度(40、45、50、55和60 ℃)、料液比(1∶9、1∶12、1∶15、1∶18和1∶21 g/mL)、加酶量(500、1000、2000、3000和4000 U/g)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Design Expert 軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[11],在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的需要,選取酶解影響因素中的pH、酶解溫度、料液比3個(gè)因素,以水解度為響應(yīng)值,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化海參內(nèi)臟酶解參數(shù)。其響應(yīng)面因素水平表如表2所示。

表2 酶解法響應(yīng)面因素水平表Table 2 Factors and levels used in respond surface methodology

1.2.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物的影響 在優(yōu)化的酶解條件下,分別酶解1、5、10、15、20 h。分析不同酶解時(shí)間酶解物清除DPPH自由基的能力。

1.2.6 酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究 制備最優(yōu)條件下海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物,并進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)。以清除DPPH自由基和羥自由基為指標(biāo),以GSH為對(duì)照,研究其抗氧化能力。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 蛋白水解度的測(cè)定 采用甲醛滴定法[12]:吸取5 mL樣液,加75 mL水,用0.01 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH8.2。加入10 mL甲醛溶液,滴定至pH9.2。記下消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的升數(shù),同時(shí)用80 mL水做空白實(shí)驗(yàn)。

式中:X為1 mL的樣液中氨基態(tài)氮的含量(g);C為NaOH溶液濃度(mol/L);V1為樣品液NaOH溶液的消耗量(mL);V0為空白液NaOH溶液的消耗量(mL);MN為氮的摩爾質(zhì)量(g/mol)。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照GB/T5009.5-2003(凱氏定氮法)。

1.3.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參考文獻(xiàn) [13],配制2×10-4mol/L的DPPH溶液。取2 mL樣液加入2 mL DPPH溶液。室溫放置30 min后,記錄517 nm吸光值A(chǔ)i;用2 mL 95%乙醇溶液與2 mL超純水調(diào)零。在2 mL DPPH溶液中加入2 mL 95%乙醇溶液,記錄吸光值為Ac,即對(duì)照,用2 mL樣品液與2 mL 95%乙醇混合為空白Aj。根據(jù)公式計(jì)算樣品的清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

1.3.4 羥自由基清除活性測(cè)定 采用水楊酸法[14];依次加入9.0 mmol/L FeSO4溶液,9.0 mmol/L水楊酸溶液和9.0 mmol/L的雙氧水各1 mL,最后加入2 mL樣品溶液。37 ℃水浴30 min,蒸餾水調(diào)零,在526 nm處測(cè)定吸光度值記為A1。以去離子水代替樣品溶液,其他步驟同上,得A0。2 mL樣品溶液加3 mL蒸餾水在526 nm處測(cè)得吸光度,得A2。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類(lèi)的選擇

Chen等[15]指出活性肽的活性不僅與其分子大小,還和其末端氨基酸的種類(lèi)有關(guān),而不同酶酶切位點(diǎn)不同,其決定了水解肽鍵的數(shù)量和位置,使得酶解產(chǎn)物活性也不同,因此酶的選擇決定了產(chǎn)物的組成、風(fēng)味、功能等性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)海參內(nèi)臟進(jìn)行水解,三種蛋白酶酶解水解度及酶解液對(duì)DPPH自由基清除活性結(jié)果見(jiàn)圖1。堿性酶的水解度最高,達(dá)到23.20%,中性酶和木瓜酶相當(dāng),達(dá)到20%,略低于堿性酶,但是中性酶的DPPH自由基清除率最高,達(dá)到15.65%。楊濤[16]等在研究中使用堿性酶酶解海參內(nèi)臟水解度雖然高達(dá)67.19%,但是其在清除羥自由基IC50為11.7 mg/mL,低于本文5.33 mg/mL。因此,綜合考慮選用中性酶為水解用酶。

圖1 不同蛋白酶水解度和DPPH自由基清除率Fig.1 Degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging activities of different proteases

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)海參內(nèi)臟酶解效果的影響 結(jié)果如圖2，水解度呈先升高再降低的趨勢(shì),在50 ℃時(shí)水解效果最好。這是因?yàn)樵诿附膺^(guò)程中,適當(dāng)?shù)臏囟瓤梢栽黾用傅幕盍?促進(jìn)水解,若溫度過(guò)高或過(guò)低,使蛋白和酶變性則對(duì)水解不利。

圖2 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.2 The influence of hydrolysis temperature on the enzymatic hydrolysis effects

2.2.2 pH對(duì)海參內(nèi)臟酶解效果的影響 如圖3可知,水解物的水解度先逐步上升,在pH為7.0時(shí),水解度達(dá)最大值,pH大于7.0以后水解度又呈下降的趨勢(shì)。故選擇pH為7.0左右合適。

圖3 pH對(duì)水解度的影響Fig.3 The influence of pH on the enzymatic hydrolysis effects

2.2.3 加酶量對(duì)海參內(nèi)臟酶解效果的影響 如圖4可知,隨著酶添加量的增大水解度呈上升趨勢(shì),但過(guò)了2000 U/g曲線(xiàn)斜率變小,周雪松[17]的研究表明,當(dāng)酶的用量大于最適濃度時(shí),過(guò)量的酶很難與底物接觸,其對(duì)底物蛋白的水解能力不會(huì)明顯提高,如果酶量過(guò)大甚至?xí)鹈傅淖匀茉鰪?qiáng)?？紤]到實(shí)驗(yàn)成本和試劑最大利用率,加酶量選為2000 U/g。

圖4 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.4 The influence of enzymatic dosage on the enzymatic hydrolysis effects

2.2.4 料液比對(duì)海參內(nèi)臟酶解效果的影響 如圖5可知,當(dāng)料液比為1∶9 g/mL到1∶12 g/mL時(shí),水解度逐漸增大,當(dāng)料液比再逐漸增大時(shí),其水解度逐步下降。這是因?yàn)殡S著料液比的增大,降低了體系中的酶濃度,使得酶促反應(yīng)速度下降,水解度降低[18]。故選擇料液比1∶12 g/mL左右較為合適。

圖5 料液比對(duì)水解度的影響Fig.5 The influence of solid-liquid ratio on the enzymatic hydrolysis effects

2.3 海參內(nèi)臟酶解參數(shù)的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析 固定酶解時(shí)間5 h,以蛋白水解度為指標(biāo),響應(yīng)面測(cè)定結(jié)果和響應(yīng)面分析結(jié)果如表3和表4所示。對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到水解度對(duì)pH(A)、溫度(B)、料液比(C)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為:

Y=18.78+0.037A-0.028B+0.27C-0.12AB+0.047AC-0.20BC-0.57A2-1.24B2-1.87C2,(R2=0.9972)

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Respond surface methodology design and experimental results

從模型方差分析(表4)可知,模型p值<0.0001,模型F值為75.37,表明該二次多項(xiàng)回歸模型高度顯著,失擬項(xiàng)0.3304>0.05,不顯著,表明模型與實(shí)際情況擬合很好,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性,可以應(yīng)用到理論預(yù)測(cè)[19]。其中料液比對(duì)水解度影響極顯著(p<0.01)。pH和溫度對(duì)水解度影響不顯著(p>0.05),影響蛋白水解度因素的主次順序?yàn)?料液比>pH>溫度。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 ANOVA for response surface

注:表中“**”代表極顯著,“*”代表顯著。

2.3.2 響應(yīng)面圖分析 采用Design-Expert 8.06軟件作圖,各因素對(duì)海參內(nèi)臟酶解水解度影響的相應(yīng)面如圖6?？梢钥闯龈鱾€(gè)因素pH(A)、溫度(B)、料液比(C)在選定的范圍內(nèi),均存在極值。在溫度(B)和pH(A)的交互關(guān)系圖中,當(dāng)固定pH時(shí),溫度對(duì)水解度呈先增加后降低的趨勢(shì);當(dāng)固定溫度時(shí),pH對(duì)水解度的影響也呈先增加后降低的趨勢(shì)。同樣的在pH(A)和料液比(C)的交互關(guān)系圖,溫度(B)和料液比(C)的交互關(guān)系圖中各個(gè)因素對(duì)水解度的影響也是如此,這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。比較三個(gè)因素的兩兩交互作用圖,溫度(B)和料液比(C)的交互關(guān)系對(duì)水解度的影響最大,表現(xiàn)為曲面比較陡。而pH(A)和料液比(C)的交互關(guān)系以及pH(A)和溫度(B)對(duì)水解度的影響相對(duì)較小,曲面圖表現(xiàn)為相對(duì)平緩,這與方差結(jié)果分析一致。

圖6 因素間相互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface figure about effect of relationship between factors

圖7 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis time on DPPH free radical scavenging activities

由SAS 8.2軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理,得出海參內(nèi)臟酶解最優(yōu)條件為:酶解溫度為49.91 ℃,pH為7.02,料液比為1∶12.22 g/mL。模型預(yù)測(cè)水解度最大為18.79%?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn),選擇溫度為50 ℃,pH為7.00,料液比為1∶12 g/mL,實(shí)測(cè)值為19.22%,驗(yàn)證了模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際水解度。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物的影響

用中性蛋白酶在最優(yōu)酶解條件下酶解,分別酶解1、5、10、15、20 h,測(cè)得相應(yīng)酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性的能力,結(jié)果如圖7所示。水解液清除DPPH自由基活性的能力隨酶解時(shí)間先增高,在10 h時(shí)后逐漸趨于平緩。這是因?yàn)殡S酶解時(shí)間的增加,大分子肽被酶解成小肽,在10 h后酶解基本完全。有研究表明如果肽段過(guò)長(zhǎng),可能由于肽的結(jié)構(gòu)關(guān)系,將使具有抗氧化性的氨基酸殘基不可暴露出來(lái),使抗氧化性降低[20]。

2.5 酶解產(chǎn)物清除自由基活性

圖8和圖9分別為,在最優(yōu)酶解條件下,海參內(nèi)臟在第10 h酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除作用?？梢钥闯龊?nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除率影響趨勢(shì)和GSH基本一致。海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物和GSH清除DPPH自由基的IC50分別為1.26、0.71 mg/mL;清除羥自由基的IC50分別為5.33、3.75 mg/mL。說(shuō)明海參內(nèi)臟中性酶酶解產(chǎn)物具有良好的清除自由基活性。

圖8 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物清除DPPH·活性Fig.8 The scavenging activity of hydrolyzate of sea cucumber viscera on DPPH·

圖9 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物清除·OH活性Fig.9 The scavenging activity of hydrolyzate of sea cucumber viscera on ·OH

3 結(jié)論

利用海參內(nèi)臟為原料,以水解度和DPPH自由基清除率為指標(biāo),綜合考慮酶解產(chǎn)物得率和抗氧化活性,確定中性酶為最適用酶。以水解度為指標(biāo),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析優(yōu)化中性酶酶解海參內(nèi)臟的工藝條件。確認(rèn)最佳酶解條件為:酶添加量2000 U/g,料液比1∶12 g/mL,酶解溫度50 ℃,酶解pH7.0,在此條件下水解度為19.22%,與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近。在抗氧化活性研究中,酶解產(chǎn)物在第10 h具有較高的清除DPPH自由基和羥自由基能力,其中清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.26、5.33 mg/mL,表明本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)海參內(nèi)臟中活性成分的利用開(kāi)發(fā)具有參考價(jià)值。

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Optimization for extracted conditions of sea cucumber visceral

YANG Jia-hong1,HUANG Yi-song2,WEI Hao-cheng1,HE Chuan-bo1,DENG Ting1,XIONG He-jian1,*

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Xiamen Fliport Catering,Xiamen 361006,China)

To establish sea cucumber viscera hydrolysis conditions and provide a reference for the industrial production of sea cucumber viscera active substance. Degree of hydrolysis and clearing DPPH free radicals were selected as the indexes to compare the effect of hydrolysis and product antioxidant activity of neutral protease,alkaline protease,papain. Neutral protease was selected as the best protease. The hydrolysis conditions was optimized by response surface methodology. The results showed the optimal hydrolysis conditions:enzyme dosage 2000 U/g,material/liquid 1∶12 g/mL,hydrolysis temperature of 50 °C,the hydrolysis conditions were pH7.0. Under this selected technological parameter,the effects of different extraction time on antioxidant activity were compared. Found that the hydrolyzate had good antioxidant activity at 10 h. Half inhibitory concentrations of DPPH radical,hydroxyl free radical were 1.26 and 5.33 mg/mL. Using a neutral enzymatic hydrolysis of sea cucumber offal process optimization was reasonable and feasible. Hydrolyzate has stronger antioxidant activity.

sea cucumber viscera;digestion;protein hydrolysis;antioxidant

2016-08-01

楊佳洪(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：功能性食品，E-mail:13666024077@163.com。

*通訊作者:熊何健(1968-)，男，碩士，教授，研究方向：功能性食品，E-mail:hjxiong@jmu.edu.cn。

廈門(mén)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20153014)；廈門(mén)市海洋漁業(yè)局(南方海洋中心)科技類(lèi)項(xiàng)目(14GZP007NF07)；福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(M20130910)。

TS254.9

B

:1002-0306(2017)03-0180-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.026