呂耀龍,李少英,趙春杰,包丹丹

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術學院,內(nèi)蒙古包頭 014109:2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌的耐藥性及gyrA基因分析

呂耀龍1,李少英2,*,趙春杰1,包丹丹1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術學院,內(nèi)蒙古包頭 014109:2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

本研究以內(nèi)蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中分離的16株乳酸菌為研究對象,采用紙片擴散法對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素四種抗菌藥進行耐藥性測定。實驗結果表明:93.75%的菌株對氧氟沙星和鏈霉素表現(xiàn)為耐藥,100%的菌株對環(huán)丙沙星和諾氟沙星表現(xiàn)為耐藥;耐藥菌株經(jīng)PCR擴增、gyrA基因編碼的氨基酸序列分析,發(fā)現(xiàn)有1株乳酸菌的耐藥性與gyrA基因突變有關。

乳酸菌,耐藥性檢測,gyrA基因分析

內(nèi)蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中富含乳酸菌資源,這些菌種在食品業(yè)、飼料業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等相關領域廣泛應用[1]。乳酸菌有著較長的安全使用歷史,近年來研究表明,抗生素在醫(yī)藥、飼料等行業(yè)使用泛濫,導致微生物耐藥問題日趨嚴重,致使人們在應對微生物性疾病時面臨嚴峻挑戰(zhàn)[2]。有研究表明,臨床分離的細菌中有近50%～70%的乳酸菌對氟喹諾酮類藥物表現(xiàn)出耐藥性[3-4]。

乳酸菌對喹諾酮類的氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氨基糖苷類的鏈霉素四種抗菌藥物表現(xiàn)為較高的耐藥率,但也存在一定的差異性[3-8]。四種抗菌藥物在不明確菌株耐藥機理的情況下盲目研究其耐藥性防控乃至用于生產(chǎn)實踐,將造成后續(xù)工作的不確定性。乳酸菌耐藥機理之一是拓撲異構酶基因突變介導,Ⅱ型拓撲異構酶(主要是DNA旋轉酶)是喹諾酮類等藥物的作用靶位,DNA旋轉酶組成之一是gyrA基因編碼A亞基[5]。本文旨在研究內(nèi)蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素四種抗菌藥物的耐藥性和耐藥機理gyrA基因分析,為乳酸菌選育提供了方向、耐藥機理研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 來自內(nèi)蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中分離純化保存的菌種,共16株,分別為:DM1、DM2、DM3、DM4、DM6、DM8、DM9、DM10、DM11、DM13、DM14、DM15、DM17、DM18、DM19、DM21;標準菌株 糞腸球菌Enterococcusfaecalis(CICC:23658)標號FC,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;質控菌株:大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC:25922)標號DC,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;瓊脂糖 Sigma公司、細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;2×Easy Tap PCR Supermix 北京全式金生物技術有限公司;DL2000 DNA Marker 北京全式金生物技術有限公司;6×Loading buffer 北京全式金生物技術有限公司;核酸染料 北京賽百盛生物工程公司;gyrA基因擴增引物:上游:5′-gagggatagcggttagatgag-3′,下游:5′-ccgttcaccagcaggttagg-3,中美泰和生物技術(北京)有限公司,查閱文獻[5]而定。

鏈霉素(C014,10 μg/片)、環(huán)丙沙星(C045,5 μg/片)、諾氟沙星(C033,10 μg/片)、氧氟沙星(C044,5 μg/片) 杭州天和微生物試劑有限公司。TPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基,按文獻[9]進行配制。

表1 紙片法使用的抗菌藥物及藥物敏感型標準(CLSI)Table 1 The standard of antibacterial drug and drug sensitivity of paper method(CLSI)

注:S(susceptible)為敏感;R(resistant)為耐藥;I(intermediate)為中度敏感。

熒光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;超凈臺 哈爾濱市東聯(lián)公司;離心機 Eppendorf公司;電泳儀 北京市六一儀器廠;PCR擴增儀 BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 按照文獻[10]中方法進行。

1.2.2 供試菌液制備 按照文獻[3]中方法進行。

1.2.3 采用紙片擴散法測定實驗菌株的抑菌直徑 用無菌的吸管吸取1 mL供試菌液,分別加入未凝固的25 mL MRS培養(yǎng)液中,充分搖勻后倒入平皿中待凝固。在凝固好的平皿中均等的放置2個藥敏紙片、1個空白紙片。同樣方法做質控菌株對照。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測量抑菌圈直徑。上述實驗每個菌株都做3次重復。

1.2.4 實驗菌株對四種抗菌藥物的敏感性判斷標準 供試菌株對四種抗菌藥物的藥敏性參照美國臨床和實驗標準協(xié)會(CLSI)[10-11]規(guī)定的標準(見表1)進行,報告該供試菌對四種抗菌藥物是敏感,用S表示,中度敏感I表示,耐藥R表示[11-12]。

1.2.5 實驗菌株DNA提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟提取。

1.2.6 實驗菌株DNA驗證 取5 μL提取后的實驗菌株DNA與0.5 μL的6×Loading buffer混勻,點入1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,觀察條帶。電泳參數(shù):電泳液為1×TBE buffer,電壓為110 V,時間為30 min。

1.2.7 PCR擴增 實驗菌株的gyrA基因引物的設定是參照文獻[5]中公布的引物進行,擴增片段為500 bp,由中美泰和生物技術(北京)有限公司提供合成。

PCR擴增體系為50 μL:模板DNA(4 μL)、上游引物(1 μL)、下游引物(1 μL)、2×Easy Tap PCR Supermix(25 μL)、ddH2O(19 μL)。

PCR循環(huán)參數(shù)[5],預變性:94 ℃、3 min,(變性:94 ℃、30 s,退火:60 ℃、30 s,延伸:72 ℃、1 min)45個循環(huán),末端延伸:72 ℃、5 min。

1.2.8 擴增產(chǎn)物驗證 將提取的DNA取5 μL點入1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,觀察條帶。電泳參數(shù):電泳液為1×TBE buffer,電壓為110 V,時間為30 min。

1.2.9 擴增產(chǎn)物測序 將1.2.7中gyrA基因引物的PCR擴增產(chǎn)物送中美泰和生物技術(北京)有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 供試菌株耐藥抑菌圈直徑及藥敏結果

供試菌株培養(yǎng)24 h后,測量培養(yǎng)皿抑菌圈直徑大小求平均值,藥敏結果見表2,耐藥率結果見表3。

表2 四種抗菌藥物對16株乳酸菌的抑菌直徑及藥敏結果Table 2 Antibacterial diameter and the susceptibility results of four kinds of antibacterial drugs treatments against 16 strains of lactic acid bacteria

注:W為在CLSI規(guī)定值范圍之內(nèi)。

表3 16株實驗菌株對四種抗菌藥物的耐藥率Table 3 Drug-resistance rates of the 16 Strains of lactic acid bacteria tested against the four kinds of Antimicrobials

表4 四種抗菌藥物對實驗菌株抑菌直徑的F檢驗Table 4 F test of four Kinds of Antimicrobials against the antibacterial diameter of 16 strains of lactic acid bacteria tested

從表2、表3結果表明,16株菌對氧氟沙星只有DM17表現(xiàn)為中度敏感,其余均為耐藥;對環(huán)丙沙星和諾氟沙星均表現(xiàn)為耐藥;對鏈霉素DM11表現(xiàn)為中度敏感,其余均為耐藥。16株實驗菌株對氟喹諾酮類和氨基糖苷類兩大類四種藥的耐藥率較高,氧氟沙星和鏈霉素為93.75%,環(huán)丙沙星和諾氟沙星為100%。

質控菌株大腸桿菌對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素的耐藥直徑均在CLSI規(guī)定允許的范圍內(nèi),說明實驗菌株耐藥直徑數(shù)值可靠準確。

2.2 實驗菌株的耐藥性分析

結合上述實驗結果做四種抗菌藥物對實驗菌株抑制性差異的分析,結果如表4。

從表4可以看出,四種抗菌藥物對乳酸菌的抑制作用差異極顯著,顯著水平p<0.01。

2.3 實驗菌株DNA提取條帶和PCR擴增條帶

DNA提取條帶如圖1所示。目的條帶與預期條帶大小一致。個別樣品出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象是因酶量過多或退火溫度低產(chǎn)生了PCR特異性產(chǎn)物。

圖1 實驗菌株總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total DNA of lactic acid bacteria tested

實驗菌株gyrA基因的PCR擴增條帶如圖2、圖3所示。

圖2 實驗菌株gyrA基因引物1PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of gyrA gene primer of lactic acid bacteria tested

圖3 標準菌株和質控菌株gyrA基因引物PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of gyrA gene primer of standardized and quality-controlled strains

分析部分實驗菌株未出現(xiàn)條帶,主要是因引物存在特異性所致。

2.4 實驗菌株gyrA基因編碼的氨基酸序列分析

將gyrA引物擴增DM21、FC和DC的測序結果輸入軟件DNASTAR中的EditSeq中翻譯成氨基酸序列,后將DM21和FC、DM21和DC分別輸入MegAlign進行氨基酸序列比對,結果詳見圖4、圖5。

由圖4的結果表明,實驗菌株DM21相對標準菌株FC的gyrA基因的堿基突變導致gyrA亞基發(fā)生氨基酸序列的改變,共有2個氨基酸發(fā)生了改變,改變位點是142位L(Leu)變?yōu)閃(Trp)、145位R(Arg)變?yōu)門(Thr)。圖5的結果表明,實驗菌株DM21相對質控菌株DC的gyrA基因的堿基突變導致gyrA亞基發(fā)生氨基酸序列的改變,共有3個氨基酸發(fā)生改變,改變位點是142位G(Gly)變?yōu)閃(Trp)、143位D(Asp)突變?yōu)镚(Gly)、145位R(Arg)變?yōu)門(Thr)。

圖4 菌株DM21和FC的gyrA基因氨基酸序列的比對結果Fig.4 Comparision results of amino acid sequence of gyrA gene of DM21 and FC

圖5 菌株DM21和DC的gyrA基因氨基酸序列的比對結果Fig.5 The comparision results of gyrA gene amino acid through DM21 and DC sequence

馬沁沁[13]等研究發(fā)現(xiàn)分離自四川地區(qū)人腸道及發(fā)酵食品的52株乳桿菌中,60%以上的菌株分別對紅霉素、萬古霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥;董春陽[14]對48株乳酸菌耐藥性研究發(fā)現(xiàn),95.83%的菌株對鏈霉素表現(xiàn)為耐藥,45.83%的菌株對環(huán)丙沙星表現(xiàn)為耐藥;秦宇軒[15]等市售酸奶中分離到100株乳酸菌,均對鏈霉素和慶大霉素耐藥;杜金城[16]等對具有抑制大腸桿菌作用的3株乳酸菌進行耐藥實驗發(fā)現(xiàn),對氨基糖苷類的抗生素展現(xiàn)出耐受,呂耀龍[17]研究內(nèi)蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對氧氟沙星的表現(xiàn)為較高的耐藥率。本實驗研究結果與以上學者實驗結果一致,16株乳酸菌對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素表現(xiàn)為較高的耐藥率,分別為93.75%、100%、100%、93.75%。于濤[18]在56株乳酸菌中共檢出5種不同的耐藥基因;霍小琰[5]通過對耐藥菌株DNA拓撲異構酶ⅡgyrA基因進行PCR擴增、測序,與敏感性大腸桿菌gyrA基因進行突變位點的比較,發(fā)現(xiàn)10株耐氟喹諾酮類抗菌藥乳酸菌的gyrA基因位點發(fā)生突變,證實實驗菌株對喹諾酮類抗菌藥產(chǎn)生的耐藥性與菌體DNA拓撲異構酶Ⅱ gyrA基因突變有直接關系。宋曉敏[19]研究乳酸菌耐藥機理發(fā)現(xiàn),耐藥菌株的gyrA和parC基因發(fā)生氨基酸突變,證實這些氨基酸突變與菌株耐氟喹諾酮類藥物有關;gyrB基因中引入了終止密碼子,出現(xiàn)無義突變,可能是菌株耐藥的原因之一。目前人類濫用抗菌藥物嚴重,乳酸菌對多數(shù)抗菌藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥,分析本實驗研究結果,發(fā)現(xiàn)部分菌株的gyrA基因的堿基突變導致gyrA亞基發(fā)生氨基酸序列的改變是致使乳酸菌耐藥的原因所在。

3 結論

16株乳酸菌中,對4種抗菌藥物表現(xiàn)為較高的耐藥率,93.75%的菌株對氧氟沙星、鏈霉素表現(xiàn)為耐藥,100%的菌株對環(huán)丙沙星、諾氟沙星表現(xiàn)為耐藥。

內(nèi)蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對部分抗菌藥物呈現(xiàn)較高的耐藥性,經(jīng)gyrA基因PCR擴增、氨基酸序列分析,菌株DM21的耐藥性與gyrA基因突變有直接關系。鑒于此,對食品工業(yè)而言,在選育高發(fā)酵力乳酸菌的同時還應考慮發(fā)酵產(chǎn)物的品質和安全性;對乳酸菌耐藥性研究而言,致使耐藥因素較多,應對拓撲異構酶基因突變、主動外排系統(tǒng)和質粒介導等逐一研究排查。

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Study on drug resistance testing and gyrA gene analysis of milk lactobacillus of Damao pastoral areas of Inner Mongolia

LV Yao-long1,LI Shao-ying2,*,ZHAO Chun-jie1,BAO Dan-dan1

(1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014109,China;2.Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The research subject of this study was sixteen strains of lactobacillus which separated from milk of Damao pastoral areas of Inner Mongolia,and paper diffusion method was used to test the drug resistance of four kinds of antibacterial drugs of ofloxacin,ciprofloxacin,norfloxacin,and streptomycin. The results showed that 93.75% of sixteen strains of lactobacillus were resistant to ofloxacin and streptomycin,and 100% of sixteen strains of lactobacillus were resistant to ciprofloxacin and norfloxacin. The results of PCR amplification and amino acid sequence analysis for all drug resistance lactobacillus showed that the resistance of one strains of lactobacillus was related to mutation of gyrA gene.

Lactobacillus;drug resistance testing;gene analysis of gyrA

2016-08-19

呂耀龍(1982-)，男，碩士研究生，講師，主要從事食品微生物研究，E-mail:lylong1982@163.com。

*通訊作者:李少英(1961-)，女，博士研究生，教授，主要從事有益微生物的研究，E-mail:nmglshy@126.com。

內(nèi)蒙古高等學?？茖W研究項目(NJ09059)；國家自然科學基金項目(31060014)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.023