蔡兆偉，凌云，蔡月琴，朱科燕，陳誠

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

高脂環(huán)境下雄激素缺乏對小型豬內(nèi)臟脂肪蓄積和炎癥基因表達(dá)的影響

蔡兆偉，凌云，蔡月琴，朱科燕，陳誠

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

目的 探討高脂環(huán)境下雄激素缺乏對小型豬內(nèi)臟脂肪沉積、血清激素以及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法 將性成熟的雄性五指山小型豬隨機(jī)分成三組，即不去勢組(SHAM)，去勢組(CAS)和去勢加睪酮組(CAS+T)，每組6只，所有動物均飼喂高脂飼料。12周實驗結(jié)束時，采血檢測血清激素水平變化，分離內(nèi)臟脂肪并進(jìn)行稱重，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測脂肪合成與脂肪分解基因以及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)果 (1)去勢顯著減少高脂飲食小型豬血清睪酮含量但增加其血清瘦素含量，給予外源性睪酮處理能夠恢復(fù)去勢小型豬血清睪酮和瘦素水平；(2)去勢導(dǎo)致高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪大量沉積，給予睪酮處理后，去勢小型豬內(nèi)臟脂肪含量顯著降低；(3)去勢和睪酮處理對高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織FAS、ACC、HSL和ATGL等脂肪代謝基因的表達(dá)沒有顯著影響；(4)去勢顯著上調(diào)高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織Leptin、CD68、CCL16、CCL23和SAA等炎癥基因的表達(dá)，采用外源性睪酮處理去勢小型豬則能降低上述基因的表達(dá)。結(jié)論 去勢誘導(dǎo)的雄激素缺乏促進(jìn)高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪沉積，并上調(diào)其內(nèi)臟脂肪組織中炎癥基因的表達(dá)，采用睪酮處理則能夠改善去勢小型豬內(nèi)臟脂肪蓄積和炎癥反應(yīng)。

雄激素；小型豬；肥胖；脂肪沉積；炎癥基因

近年來，隨著人口老齡化和生活方式的轉(zhuǎn)變，肥胖等慢性代謝性疾病的發(fā)病率急劇攀升，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的社會問題。流行病學(xué)資料顯示，中老年男性體內(nèi)的雄激素水平隨增齡而逐漸降低，體內(nèi)的脂肪含量則顯著增加[1]。動物實驗表明，睪酮剝奪能夠增加小鼠體內(nèi)脂肪堆積，引起肥胖[2]。我們前期試驗也發(fā)現(xiàn)，去勢能夠促進(jìn)飼喂普通飼料的豬脂肪沉積和肥胖發(fā)生[3]。這些結(jié)論提示，肥胖與雄激素水平下降之間存在著密切的關(guān)系。最近研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食(尤其是日糧膽固醇攝入增加)也是引發(fā)肥胖的重要風(fēng)險因素，如高膽固醇飲食誘導(dǎo)猴和小鼠內(nèi)臟脂肪組織炎癥反應(yīng)和脂肪細(xì)胞肥大并導(dǎo)致肥胖[4,5]。盡管雄激素缺乏和高脂飲食均是夠誘導(dǎo)脂肪沉積和肥胖的獨立危險因素，但雄激素缺乏對高脂環(huán)境下內(nèi)臟脂肪沉積和肥胖的影響目前卻仍不清楚。

本研究通過建立雄激素缺乏調(diào)控高脂飲食小型豬肥胖的動物模型，觀察高脂誘導(dǎo)環(huán)境下去勢和睪酮處理對小型豬內(nèi)臟脂肪沉積的影響，并進(jìn)一步探討脂肪合成、脂肪分解以及炎癥相關(guān)基因在雄激素缺乏調(diào)控內(nèi)臟脂肪沉積中的作用，旨在為老年性雄激素缺乏引起的肥胖提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

普通級雄性五指山小型豬18只，體重(11.72±0.38)kg，6～7月齡，購自廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司[SCXK(粵)2013-0022]，飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心 [SYXK(浙)2013-0183]，并按實驗動物3R原則給予人道的關(guān)懷。小型豬按體重隨機(jī)分成3組：不去勢組(SHAM)、去勢組(CAS)和去勢+睪酮組(CAS+T)，每組6只。手術(shù)去勢在無菌和麻醉環(huán)境下進(jìn)行，將小型豬陰囊處切口后將睪丸去除，不去勢組小型豬在陰囊處進(jìn)行切口但不去除睪丸(偽手術(shù)組)，去勢+睪酮組小型豬是小型豬去勢后隨后注射丙酸睪酮注射液(10 mg/kg 體重)。三組動物均飼喂高脂高膽固醇飼料(高脂飼料配方：1.5%膽固醇、10%蛋黃粉、0.5% 食鹽、15%起酥油、73%基礎(chǔ)飼料)，自由飲水，實驗周期為12周。實驗動物及分組見我們前期發(fā)表文獻(xiàn)[6]。

1.2 脂肪樣本采集和稱重

所有實驗動物在12周時處死，處死前進(jìn)行空腹稱重。迅速采集內(nèi)臟脂肪組織樣本，置入液氮中速凍，隨后保存在-80℃?zhèn)溆谩７蛛x小型豬內(nèi)臟脂肪并稱重，計算內(nèi)臟脂肪率：內(nèi)臟脂肪重(kg)/體重(kg)×100%。

1.3 血清激素檢測

12周實驗結(jié)束后，禁食12 h，取血并分離血清，采用ELISA試劑盒檢測血清中睪酮(T)和瘦素(leptin)含量，實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 RNA提取及熒光定量PCR檢測

采用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)提取脂肪組織總RNA，具體步操作驟參照說明書進(jìn)行。提取RNA的濃度和純度用Nano 2000微量核酸測定儀檢測，合格后備用。每個樣品取1 μg總RNA，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的mRNA序列，采用Oligo 6軟件設(shè)計引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計并合成(表1)。所有熒光定量PCR反應(yīng)在美國伯樂IQ-5熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個樣品的PCR反應(yīng)重復(fù)3次，并根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性。目的基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt方法計算。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用Tukey方法進(jìn)行處理，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂狀態(tài)下去勢和睪酮處理對小型豬血清激素水平的影響

去勢和睪酮處理對高脂飲食小型豬血清T和leptin水平的影響見圖1。由圖可見，小型豬去勢后，血清T水平顯著降低，而血清leptin水平顯著升高(P<0.01)，并且采用外源性T處理能夠恢復(fù)去勢小型豬血清T和leptin水平。另外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，小型豬血清T水平和血清leptin水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(圖1B)。

2.2 高脂狀態(tài)下去勢和睪酮處理對小型豬內(nèi)臟脂肪沉積的影響

去勢和睪酮處理對高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪沉積的影響見圖2。高脂飲食環(huán)境下去勢和睪酮處理對小型豬體重沒有顯著影響(圖2A)，但顯著影響小型豬內(nèi)臟脂肪含量。如圖2所示，去勢小型豬內(nèi)臟脂肪率極顯著高于不去勢小型豬(P<0.01)，并且睪酮處理后能減少去勢小型豬增加的內(nèi)臟脂肪含量(P<0.01)(圖2B)。

注：A：血清睪酮和瘦素水平。a: 不去勢；b: 去勢；c: 去勢+睪酮。B：血清睪酮和血清瘦素相關(guān)性。** P <0.01。圖1 高脂狀態(tài)下去勢和睪酮處理對小型豬血清睪酮和瘦素水平的影響Note. A: Serum testosterone and leptin levels. a: Sham-operated(SHAM) group; b: Castration(CAS) group; c: Castration plus testosterone treatment(CAS+T). B: Correlation between serum testosterone and leptin levels.** P <0.01. Fig.1 Effects of castration and testosterone replacement on serum testosterone and leptin levels in the miniature pigs fed a high-fat diet

2.3 高脂狀態(tài)下去勢和睪酮處理對小型豬內(nèi)臟脂肪組織基因表達(dá)的影響

去勢和睪酮處理對高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織基因表達(dá)的影響見圖3。由圖可見，去勢和睪酮處理對高脂誘導(dǎo)的小型豬內(nèi)臟脂肪組織脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、激素敏感酯酶(HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)等脂肪代謝基因的表達(dá)沒有明顯影響(P>0.05)(圖3A和3B)。雄激素缺乏顯著影響高脂誘導(dǎo)小型豬內(nèi)臟脂肪組織炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。與不去勢小型豬相比，去勢小型豬脂肪組織中l(wèi)eptin、CD68分子(CD68)、CC類趨化因子配體16(CCL16)、CC類趨化因子配體23(CCL23)和重組人血清淀粉樣蛋白A(SAA)基因的表達(dá)均顯著升高，采用睪酮處理則下調(diào)去勢小型豬內(nèi)臟脂肪組織上述基因的表達(dá)(P<0.05)。另外，去勢和睪酮處理對高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05)(圖3C)。

注：A：體重。a: 不去勢； b: 去勢； c: 去勢+睪酮； B：脂肪率。** P<0.01。圖2 高脂狀態(tài)下去勢和睪酮處理對小型豬內(nèi)臟脂肪沉積的影響Note. A: Body weight; a: Sham-operated(SHAM) group; b: Castration(CAS) group; c: Castration Plus testosterone treatment(CAS+T)group. B: Visceral fat percentage.** P<0.01. Fig.2 Effects of castration and testosterone treatment on serum lipid levels in the miniature pigs fed a high-fat diet

注：A：脂肪合成基因。a: 不去勢；b: 去勢；c: 去勢+睪酮；B：脂肪分解基因；C：炎癥基因。* P<0.05，** P<0.01。圖3 高脂狀態(tài)下去勢和睪酮處理對小型豬內(nèi)臟脂肪組織基因表達(dá)的影響Note. A: Lipogenic genes; a: Sham-operated(SHAM)group; b: Castration(CAS)group; c: Castration plus testosterone treatment(CAS+T)group. B: Lipolysis genes; C: Inflammatory genes.* P<0.05,** P<0.01. Fig.3 Effects of castration and testosterone treatment on gene expression in visceral adipose tissue in the miniature pigs fed a high-fat diet

3 討論

大量研究表明，老年男性隨著年齡增長，體內(nèi)的雄激素水平不斷降低，易患肥胖等代謝紊亂疾病的風(fēng)險[1]。目前認(rèn)為，高脂飲食尤其是膽固醇攝入增加也是誘導(dǎo)脂肪沉積并引發(fā)肥胖的重要風(fēng)險因素[4-5]。但迄今為止，雄激素缺乏對高脂飲食環(huán)境下肥胖的影響卻并不清楚。本研究以小型豬為動物模型，分析了高脂狀態(tài)下去勢和補(bǔ)充睪酮對內(nèi)臟脂肪沉積的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去勢誘導(dǎo)的雄激素缺乏促進(jìn)高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪大量沉積，給予外源性睪酮處理則減少去勢小型豬增加的內(nèi)臟脂肪含量。這和最近發(fā)表的一項小鼠上的研究相似，Dubois等[7]研究發(fā)現(xiàn)，性腺去除結(jié)合高脂飲食能夠加速小鼠腹部脂肪沉積和胰島素抵抗。

研究已證實，脂肪組織(尤其是內(nèi)臟脂肪組織)作為一種重要的內(nèi)分泌器官，能夠分泌多種脂肪因子和炎癥因子[8]。Leptin是最早發(fā)現(xiàn)的由白色脂肪組織合成和分泌的一種脂肪因子，我們發(fā)現(xiàn)去勢不僅增加高脂飲食小型豬血清leptin含量，還上調(diào)其內(nèi)臟脂肪組織leptin基因的表達(dá)，并且補(bǔ)充睪酮能降低去勢小型豬血清leptin水平和脂肪組織leptin表達(dá)。研究表明，血清leptin含量與體內(nèi)脂肪含量成正比；當(dāng)脂肪含量增加時，脂肪組織leptin分泌會增多[8]。所以，去勢小型豬內(nèi)臟脂肪組織leptin表達(dá)升高可能和其具有較高的內(nèi)臟脂肪含量有關(guān)。SAA是一種新的促炎脂肪因子，它可以誘導(dǎo)趨化多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎性因子，在肥胖和胰島素抵抗的形成中起著重要作用[9]。我們發(fā)現(xiàn)，去勢小型豬內(nèi)臟脂肪組織SAA表達(dá)顯著高于不去勢和去勢加睪酮處理組小型豬。de Oliveira等[10]研究表明，高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠內(nèi)臟脂肪組織SAA表達(dá)升高，而 SAA敲除能夠抵抗高脂誘導(dǎo)的小鼠肥胖并減少其脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤，這和本文中去勢小型豬內(nèi)臟脂肪SAA表達(dá)升高的結(jié)果相似。我們還發(fā)現(xiàn)，去勢上調(diào)高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織中趨化因子CLL16和CCL23基因的表達(dá)。Starr等[11]研究表明，肥胖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞分泌的趨化因子活化和吸引各種炎性細(xì)胞進(jìn)入脂肪組織，造成脂肪組織的慢性低度炎癥，這和本文的研究結(jié)果相一致。近年來發(fā)現(xiàn)，肥胖個體的脂肪組織巨噬細(xì)胞的浸潤顯著增加，并有研究表明脂肪組織的炎性反應(yīng)因子許多是由浸潤的巨噬細(xì)胞分泌[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)，去勢能夠增加高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織巨噬細(xì)胞特異性的標(biāo)志物CD68的表達(dá)，提示雄激素缺乏誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪組織慢性低度炎癥可能與脂肪組織中過多的巨噬細(xì)胞浸潤有關(guān)。上述研究結(jié)果表明，雄激素缺乏能夠誘導(dǎo)高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織促炎因子的表達(dá)升高，導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生。

脂肪組織沉積是脂肪合成代謝和分解代謝的一種平衡狀態(tài)，當(dāng)合成代謝增強(qiáng)或分解代謝減弱時會導(dǎo)致脂肪沉積增加[3]。我們分析了去勢和補(bǔ)充睪酮對高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織脂肪合成(FAS和ACC)和分解(HSL和ATGL)代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去勢和睪酮處理對內(nèi)臟脂肪組織脂肪合成與代謝的基因表達(dá)均沒有顯著影響，表明高脂飲食狀態(tài)下雄激素缺乏誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪堆積可能不是由脂肪代謝基因改變引起的。

綜上所述，雄激素缺乏能夠加速高脂飲食誘導(dǎo)的小型豬內(nèi)臟脂肪蓄積和肥胖。雖然雄激素缺乏不影響高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織脂肪合成與分解代謝基因的表達(dá)，但顯著增加其炎癥基因表達(dá)。另外，補(bǔ)充外源性睪酮能夠降低高脂飲食小型豬內(nèi)臟脂肪組織炎癥基因的表達(dá)，改善雄激素缺乏誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪蓄積和肥胖。

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Effects of androgen deficiency on visceral fat accumulation and inflammatory gene expression in miniature pigs fed a high-fat diet

CAI Zhao-wei*, LING Yun, CAI Yue-qin, ZHU Ke-yan, CHEN Cheng

(Laboratory Animal Research Center/Comparative Medical Research Center,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective The aim of this study was to explore the effect of androgen deficiency on serum hormone levels, visceral fat accumulation and inflammatory gene expression in miniature pigs fed a high-fat diet (HFD). Methods Sexually mature male Chinese Wuzhishan miniature pigs were divided into three groups (animals/group) as follows: intact male pigs (SHAM), castrated male pigs (CAS) and castrated male pigs plus testosterone treatment (CAS+T). The pigs were fed a HFD diet for 12 weeks. Serum levels of testosterone and leptin were measured and visceral fat were dissected and weighted. qRT-PCR was performed to determine the mRNA expression levels of lipogenic, lipolysis and inflammation related genes. Results (1) Serum testosterone levels were significantly decreased but serum leptin levels were significantly increased in the castrated pigs. These effects were recovered after testosterone treatment. (2) Visceral fat percentage was significantly increased in the castrated pigs, and testosterone treatment reduced the increased visceral fat in the castrated pigs. (3) Castration and testosterone treatment had no significant effects on the expression levels of lipogenic genes (FAS and ACC) and lipolysis genes (HSL and ATGL) in pigs fed a HFD. (5) Castration significantly induced the expressions of inflammatory genes including Leptin, CD68, CCL16, CCL23 and SAA, and testosterone treatment recovered the expressions of the above genes in the castrated pigs. Conclusions Castration-induced testosterone deficiency promotes visceral fat accumulation and upregulates the expression levels of inflammatory genes in miniature pigs fed a HFD. Moreover, testosterone treatment ameliorates castration-induced visceral fat accumulation and inflammatory response in HFD-fed pigs.

Testosterone; Miniature pigs; Obesity; Fat accumulation; Inflammatory gene

CAI Zhao-wei，E-mail: czw1234@163.com

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究(實驗動物)計劃項目(編號：2014C37010)； 國家自然科學(xué)基金項目(編號：31200921)。

蔡兆偉(1983-)，男，副研究員，研究方向為動物分子遺傳。E-mail: czw1234@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0074-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.014

2016-06-23