李嘉琳，李夢詩，李斌，亓翠玲，王麗京

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

P-選擇素缺失對小鼠生理特征的影響

李嘉琳，李夢詩，李斌，亓翠玲，王麗京*

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

目的 探討P-選擇素基因(P-selectin)缺失對小鼠生理特征的影響。方法 P-選擇素敲除(PKO)小鼠和C57小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中，通過基因鑒定確定其為純和PKO小鼠。觀察PKO小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、繁育狀況，檢測血常規(guī)，確定P-選擇素敲除后對小鼠一般情況的影響。分別于6周和18周處死小鼠，通過伊紅&蘇木素(HE)染色，觀察P-選擇素敲除后對小鼠各個(gè)臟器組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果 PKO小鼠與正常C57小鼠的繁育狀況相似，血常規(guī)無異常，HE染色發(fā)現(xiàn)PKO小鼠肝、脾、肺、腎組織結(jié)構(gòu)均較正常。結(jié)論 P-選擇素的缺失不會(huì)對小鼠生殖繁育、血液造成影響，對重要的組織臟器也未見明顯影響，為以后進(jìn)一步研究P-選擇素在疾病中的作用提供了動(dòng)物模型研究理論基礎(chǔ)。

P-選擇素；P-選擇素敲除小鼠；動(dòng)物模型

P-選擇素(CD62P)是選擇素家族中的一員，還包括L-選擇素(CD62L)和E-選擇素(CD62E)，這些選擇素主要在白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間發(fā)揮作用，介導(dǎo)兩者之間的粘附作用。當(dāng)發(fā)生血栓或炎癥反應(yīng)時(shí)，儲(chǔ)存于血小板α-顆粒和血管內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體中的P-選擇素[1-3]迅速表達(dá)于血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面，與P-選擇素配體(PSGL-1)結(jié)合介導(dǎo)血小板、內(nèi)皮細(xì)胞與單核、中性粒細(xì)胞之間的粘附作用，因此P-選擇素在血栓形成和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4]。P-選擇素還可以促進(jìn)腫瘤的生長[5-6]?；蚬こ绦∈?GEM)是對實(shí)驗(yàn)小鼠基因組進(jìn)行有目的地改造，使其具有某種生物特性以便于對這種基因功能進(jìn)行研究[7]。本實(shí)驗(yàn)小鼠為P-選擇素基因敲除小鼠(PKO小鼠)，旨在通過對PKO小鼠進(jìn)行生物學(xué)特征及組織病理學(xué)觀察，研究P-選擇素缺失后對小鼠一般生理特征的影響，為進(jìn)一步研究P-選擇素在疾病中的作用提供提供了動(dòng)物模型研究理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)P-選擇素(P-selectin)基因敲除小鼠(簡稱PKO小鼠)純合子雌雄各兩只，6～8周齡，體重18～22 g，購于美國 Jackson 實(shí)驗(yàn)室，由密歇根大學(xué)耿建國教授惠贈(zèng)，背景為C57BL/6J(簡稱C57)小鼠。清潔級(jí)C57小鼠20只，雌雄各半，5～6周齡，體重18～22 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中[SCXK(粵)2014-0035]。所有小鼠組織取材于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(粵)2012-0125]。所有操作符合實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求。

1.2 主要儀器及試劑

顯微鏡(徠卡公司)；PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；石蠟切片機(jī)(徠卡公司)；包埋機(jī)(YAGUANG)；生物組織攤烤片機(jī)(YAGUANG)；凝膠成像儀(基因有限公司)；低溫離心機(jī)(美國熱電公司)；VMC64S7獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具(蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠)；制冰機(jī)(勱克生物公司)；蛋白酶K、dNTP(Sigma公司)；PCR引物合成(上海英濰捷基公司)；二甲苯、乙醇(廣州康龍公司)；抗凝管(廣州康龍公司)；乙醚(廣州康龍公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠的飼養(yǎng)和繁育

C57 PKO小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，光照控制(12 h明/12 h暗)，室溫22～26℃，相對濕度50%～65%。將雄性和雌性PKO小鼠以1∶1進(jìn)行全同胞兄妹方式交配，懷孕的母鼠單獨(dú)放置一個(gè)籠位。每天觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)及飲食情況，及時(shí)記錄小鼠受孕時(shí)間及產(chǎn)仔數(shù)，對配對的小鼠定期給予一定量的葵瓜子或煮熟的雞蛋以補(bǔ)充營養(yǎng)。

1.3.2P-selectin基因的鑒定

(1)PKO小鼠組織DNA的提取

75%乙醇消毒剪刀后剪取約2 mm的鼠尾于1.5 mL離心管中，加入25 mmol/L NaOH 500 μL，使組織完全浸沒，金屬浴100℃ 1 h，冷卻后加入40 mmol/L TrisHCl(pH 5.5)500 μL，離心3000 r/min 5 min。取1 μL上清進(jìn)行PCR反應(yīng)。

(2)擴(kuò)增目的條帶

引物1： 5′-CTG AAT GAA CTG CAG GAC GA-3′; 引物2： 5′-ATA CTT TCT CGG CAG GAG CA-3′; 引物3： 5′-TTG TAA ATC AGA AGG AAG TGG-3′; 引物4： 5′-AGA GTT ACT CTT GAT GTA GAT CTCC-3′。PCR反應(yīng)物配制：2X Mix 25 μL，引物1、2、3、4各1 μL，三蒸水20 μL，DNA 1 μL，總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性3 min，94℃ 20 s，64℃ 30 s( 每個(gè)循環(huán)依次減少0.5℃ )，72℃ 35 s，共循環(huán)12次；94℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 35 s，共循環(huán)25次；72℃延伸 2 min，10℃冷卻擴(kuò)增產(chǎn)物。

(3)瓊脂糖電泳及基因型鑒定

制備1.2%瓊脂糖凝膠電泳，取7.5 μL的PCR產(chǎn)物及DNA marker分別加入孔中，進(jìn)行電泳分析。PKO-/-只有1條帶為172 bp,PKO+/-有兩條帶，1條帶為322 bp,另1條帶為172 bp。

1.3.3 血常規(guī)

選擇成熟的雄性小鼠C57和PKO各6只，乙醚麻醉后，從眼框靜脈叢取血200 μL，EDTAK2抗凝，冰上送檢至廣東省動(dòng)物檢測所，檢測以下血常規(guī)指標(biāo)，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)、嗜酸性細(xì)胞數(shù)、嗜堿性細(xì)胞數(shù)等。

1.3.4 HE染色

分別選擇6周和18周的C57和PKO小鼠，脫頸椎法處死，取心肝脾肺腎組織，4%中性甲醛溶液固定12～24 h后脫水處理，脫水順序?yàn)?0%乙醇30 min，80%乙醇30 min，95%乙醇30 min，無水乙醇I，無水乙醇II，二甲苯I，二甲苯II，低熔點(diǎn)蠟，高熔點(diǎn)蠟(60℃)均1 h，常規(guī)包埋切片，切片厚度為4 μm。脫蠟：按照常規(guī)脫蠟方法，二甲苯I，二甲苯II各20 min，無水乙醇，95%乙醇各1 5min，95%乙醇10 min，90%乙醇5 min,80%乙醇5 min進(jìn)行脫蠟。PBS洗一次，蘇木素染色2 min，流水反藍(lán)30 min，伊紅染色20 s，常規(guī)脫水處理，晾干后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，取視野正中部分100倍、400倍拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKO小鼠鑒定

注：M.DNA marker 1000；1～3.PKO-/-； 4.PKO+/-。圖1 P-選擇素基因敲除小鼠的鑒定圖Note.M.DNA marker 1000；1～3.PKO-/-； 4.PKO+/-.Fig.1 Identification of PKO mice

為確定該小鼠確為PKO小鼠，我們對其基因進(jìn)行鑒定。PKO-/-：只有1條帶，為172 bp，如圖1中，1～3號(hào)均為PKO-/-；PKO+/-有兩條帶，1條帶為322 bp，另1條帶為172 bp，如圖1中4號(hào)所示。

2.2 PKO小鼠繁育情況

將8～10周的雄性和雌性PKO小鼠1∶1進(jìn)行配種，共4籠。通過觀察發(fā)現(xiàn)PKO小鼠的繁育周期與正常C57小鼠一樣均為1個(gè)月左右，且每胎產(chǎn)仔數(shù)與C57小鼠相似，說明P-選擇素基因的敲除，對小鼠生殖繁育沒有影響。

圖2 PKO小鼠繁育周期和每窩產(chǎn)仔數(shù)與正常C57小鼠相似Fig.2 Days of reproductive cycle and number of puppies per litter of the mice

2.3 PKO小鼠主要臟器與正常小鼠C57組織病理學(xué)觀察對比

2.3.1 P-選擇素基因的缺失對小鼠肝組織結(jié)構(gòu)無影響

分別于6周和18周時(shí)處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠肝組織結(jié)構(gòu)均較正常。P-選擇素基因的缺失不會(huì)對小鼠肝組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。(見圖3)

2.3.2 P-選擇素基因的缺失對小鼠脾組織結(jié)構(gòu)無影響

分別于6周和18周時(shí)處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠脾組織結(jié)構(gòu)均較為正常。P-選擇素基因的缺失不會(huì)對小鼠脾組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。(見圖4)

2.3.3 P-選擇素基因的缺失對小鼠肺組織結(jié)構(gòu)無影響

分別于6周和18周時(shí)處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠肺組織結(jié)構(gòu)均較為正常。P-選擇素基因的缺失不會(huì)對小鼠肺組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。(見圖5)

2.3.4 P-選擇素基因的缺失對小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)無影響

分別于6周和18周時(shí)處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠腎組織結(jié)構(gòu)均較正常。P-選擇素基因的缺失不會(huì)對小鼠腎組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。(見圖6)

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時(shí)，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對肝組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。圖3 PKO和C57小鼠肝臟組織HE染色Fig.3 Histology of the liver of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時(shí)，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對脾組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。圖4 PKO和C57小鼠脾臟組織HE染色Fig.4 Histology of the spleen of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

2.4 PKO小鼠血常規(guī)檢測

通過血常規(guī)檢測紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖7A RBC)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖7B WBC)、血小板計(jì)數(shù)(圖7C PLT)、淋巴細(xì)胞數(shù)(圖7D)、單核細(xì)胞數(shù)(圖7E)、中性粒細(xì)胞數(shù)(圖7F)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(圖7G)發(fā)現(xiàn)PKO小鼠的血常規(guī)均在正常范圍內(nèi)(見圖7)。

3 討論

粘附分子(adhesion molecules, AM)是一類主要分布在細(xì)胞表面或是細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，大多為糖蛋白主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附作用[10]。L選擇素(L-selectin)、E-選擇素(E-selectin)和P-選擇素(P-selectin)是選擇素家族成員，由最初發(fā)現(xiàn)這三種選擇素的三種細(xì)胞leukocyte、endothelium和platelet命名，參與多種生理及病理過程，如介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢、白細(xì)胞浸潤炎癥組織、血栓形成以及腫瘤轉(zhuǎn)移等。P-選擇素主要存儲(chǔ)于血小板的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞的韋伯氏小體中，當(dāng)血小板或內(nèi)皮細(xì)胞活化后，P-選擇素迅速表達(dá)于血小板(僅需幾秒)或內(nèi)皮細(xì)胞(需數(shù)分鐘)的表面，介導(dǎo)血小板或內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞之間的粘附作用，從而在血栓形成和炎癥反應(yīng)中具有重要作用[11]。近年來發(fā)現(xiàn)P-選擇素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用，例如，我們實(shí)驗(yàn)室亓翠玲等[6]發(fā)現(xiàn)P-選擇素介導(dǎo)的血小板粘附促進(jìn)腫瘤的生長，血小板可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，P-選擇素的缺失可抑制血小板在腫瘤組織的聚集，減少血管內(nèi)皮分泌生長因子及血管形成，從而抑制腫瘤生長。P-選擇素的配體如P-選擇素糖蛋白配體-1 ( PSGL-1 )，表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞上，如肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、腎癌、鱗狀上皮癌等，通過與P-選擇素結(jié)合介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血小板或內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移[12]。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中P-選擇素表達(dá)增加促進(jìn)新生血管的形成，并且細(xì)胞表面黏附分子和內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用對于腫瘤的轉(zhuǎn)移和新生血管形成有著重要作用[13]。

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時(shí)，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對肺組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。圖5 PKO和C57小鼠肺組織HE染色 and high power lens(×400). Fig.5 Histology of the lungs of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時(shí)，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對腎組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。圖6 PKO和C57小鼠腎組織HE染色Fig.6 Histology of the kidneys of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

綜上所述，通過對P-選擇素基因敲除小鼠一般狀態(tài)的觀察及重要組織臟器的HE染色，發(fā)現(xiàn)P-選擇素基因的缺失不會(huì)對PKO小鼠的生殖和繁育造成影響，對血液、各主要臟器無明顯影響，說明P-選擇素的缺失對小鼠一般生理功能沒有影響。通過對P-選擇素基因敲除小鼠生理特征的研究，為P-選擇素與腫瘤、炎癥等疾病的研究提供了動(dòng)物模型研究理論基礎(chǔ)。總之，通過對轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物學(xué)特征和病理學(xué)的觀察，對探究基因與疾病關(guān)系和新藥研發(fā)具有重要意義。

注：(A)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)；(B)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)；(C)血小板計(jì)數(shù)(PLT)；(D)淋巴細(xì)胞數(shù)；(E)單核細(xì)胞數(shù)；(F)中性粒細(xì)胞數(shù)；(G)嗜酸性細(xì)胞數(shù)。圖7 PKO小鼠與C57小鼠血常規(guī)比較Note.(A)Red blood cell count;(B)White blood cell count;(C)Blood platelet count; (D)Lymphocyte count;(E)Monocyte count;(F)Neutrophil count;(G)Eosnophil count.Fig.7 Comparison of the routine blood test of ther PKO and C57 mice

[1] Furie B, Furie BC. The molecular basis of platelet and endothelial cell interaction with neutrophils and monocytes: role of P-selectin and the P-selectin ligand, PSGL-1[J]. Thromb Haemost,1995，74:224-7.

[2] Hartwell DW, Wagner DD. New discoveries with mice mutant in endothelial and platelet selectins[J]. Thromb Haemost,1999，82:850-7.

[3] Chen M, Geng JG. P-selectin mediates adhesion of leukocytes, platelets, and cancer cells in inflammation, thrombosis, and cancer growth and metastasis[J]. Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2006, 54:75-84.

[4] Romo GM, Dong JF, Schade AJ,et al. The glycoprotein Ib-IX-V complex is a platelet counterreceptor for P-selectin[J]. J Exp Med, 1999, 190:803-14.

[5] Qi CL，Li B，Guo SM，et al. P-selectin-mediated adhesion between platelets and tumor cells promotes intestinal tumorigenesis in ApcMin/+ mice.[J]. Int J Biol Sci，2015，11(6):679-87.

[6] Qi CL，Wei B，Ye J，et al. P-selectin-mediated platelets adhesion promote tumor growth [J]. Oncotarget，2015, 6(9):6584-6569.

[7] Waton AL，Anderson LK，Greeley AD，et al. Co-targeting the MAPK and PI3K/AKT/mTOR pathway in two genetically engineered mouse models of Schwann cell tumors reduces tumor grade and multiplicity[J].Oncotarget,2014,5(6):1502-1514.

[8] 寧磊,王保寧.基因工程小鼠研究現(xiàn)狀[J].青?？萍?2000,7:46-47.

[9] Nomura T.Practical development of genetically engineered animals as human disease models[J].Lab Anim Sci,1997,47(2):113-117.

[10] Libby P.Inflammation in atherosclerosis[J].Nature.2002;420:868-874.

[11] 馮利鋒. c-Cbl介導(dǎo)的對P-選凝素誘導(dǎo)β2整合素活化的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制的研究和SHKBP1抑制表皮生長因子受體(EGFR)信號(hào)負(fù)調(diào)控機(jī)理的研究[D]. 浙江大學(xué), 2008.

[12] Monzavi-KB，Stanley JS, Hennings L,et al. Chondroitin sulfate glycosaminoglycans as major P-selectin ligands on metastatic breast cancer cell lines[J].Int J Cancer,2007,120:1179-1191.

[13] Iwamura T,Caffrey TC, Kitamura N, et al. P-seletin expression in a metastatic pancreatic tumor cell line(SUTT-2)[J].Cancer Res,1997,57:1206-1212.

Effects ofP-selectingene knockout on the biological characteristics of mice

LI Jia-lin，LI Meng-shi，LI Bin，QI Cui-ling，WANG Li-jing*

(Vascular Biology Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China)

Objective To investigate the effects ofP-selectingene knockout on the biological characteristics of mice. MethodsP-selectinknockout (PKO) mice and C57BL/6 mice were housed in SPF environment. To make sure that the mice were pure PKO mice by gene identification. To determine the general condition, the activity status, reproduction ofP-selectinknockout mice were observed and tested. HE staining was used to observed the histological morphology and structures of 6-week-old and 18-week-oldP-selectinknockoutout mice. Results PKO mice and C57 mice have similar multiplication, there was no significant difference in reproduction and blood routine test. The stuctures of liver, spleen, lung and kidney were normal. ConclusionsP-selectinknockout has no significant effects on reproduction, blood routine test and major organs.This research provides animal model theoretical basis for further study on the effects of P-selection in diseases.

P-selectin;P-selectinknockout mice; Animal model

WANG Li-jing, E-mail: wanglijing62@163.com

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471290)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(51343072)。

李嘉琳(1990-),女，碩士研究生，專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)。E-mail: lijialin124@163.com

王麗京(1962-),女，教授，研究方向：腫瘤微環(huán)境、模式動(dòng)物疾病模型。E-mail: wanglijing62@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0014-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.003

2016-06-27