戴冰，張嘉妮，楊夢(mèng)琳，李玉星，肖子曾*，楊磊，韋強(qiáng)

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208)

氫化可的松致腎虛證小鼠模型的建立及相關(guān)指標(biāo)的評(píng)價(jià)

戴冰1，張嘉妮2，楊夢(mèng)琳2，李玉星2，肖子曾2*，楊磊1，韋強(qiáng)1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208)

目的 建立氫化可的松致腎陽(yáng)虛、腎陰虛小鼠模型，并探討其相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)。方法 采用氫化可的松灌胃建立腎陽(yáng)虛及腎陰虛小鼠模型；觀察腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型小鼠生存狀態(tài)，測(cè)定各組模型小鼠體重變化；采用放射免疫法檢測(cè)HPA軸中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(Cor.)、HPT軸中甲狀腺激素 (TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、HPG軸中促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)含量。結(jié)果 腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型小鼠體重均下降，腎陽(yáng)虛模型小鼠血清ACTH、Cor.、TSH、T3、T4水平降低，血清FSH、E2、T水平升高，且差異均有顯著性(P<0.01)；而腎陰虛模型則反之。結(jié)論 腎虛小鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)中ACTH、Cor.、TSH、T3、T4、FSH、E2、T各激素水平均發(fā)生了改變，其中Cor.可作為評(píng)價(jià)糖皮質(zhì)激素法建立腎虛模型的重要指標(biāo)。

腎陽(yáng)虛；腎陰虛；評(píng)價(jià)指標(biāo)

腎虛模型是具有代表性的中醫(yī)動(dòng)物模型， 是中醫(yī)根本臟器的虛損、 證候模型。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于中醫(yī)腎虛理論的不斷深入研究，目前已積累了大量腎虛動(dòng)物模型的建立方法[1]，其常用的糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物有氫化可的松、醋酸可的松、醋酸氫化可的松、地塞米松磷酸鈉、地塞米松等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用氫化可的松連續(xù)灌胃4 d，可使小鼠血漿cAMP含量升高，能成功復(fù)制出良好的腎陰虛小鼠模型[2]。雖然現(xiàn)已對(duì)腎虛模型有較深入的研究，但由于臨床上對(duì)腎虛病癥尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)可控的生化診斷指標(biāo)，使模型在模擬腎虛證候的研究中僅能反映某一方面的病理變化特征，并不能完全體現(xiàn)臨床上疾病發(fā)生的復(fù)雜性和中醫(yī)單一病因的復(fù)雜性[3]，因此建立規(guī)范、 標(biāo)準(zhǔn)、可重復(fù)的理想腎虛動(dòng)物模型具有一定的困難；目前用于評(píng)價(jià)腎虛模型的指標(biāo)還尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，其大多僅以造模動(dòng)物的一般體征變化作為觀察指標(biāo)，或少有以生化指標(biāo)如動(dòng)物體內(nèi)cAMP、cGMP含量對(duì)腎虛模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差，缺乏一定的科學(xué)性，故腎虛模型的建立方法及評(píng)價(jià)相關(guān)指標(biāo)的選擇仍值得探討研究。

中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，藏精氣，主骨、生髓、化血，主持人體生長(zhǎng)發(fā)育、生殖和調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，為正氣之根。現(xiàn)代研究進(jìn)展表明，腎虛者往往表現(xiàn)為NIM中的內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙即下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能失調(diào)，性腺軸(HPG)和甲狀腺軸(HPT)功能紊亂[4-6]。因此，本研究根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[7]中腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型的造模方法，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，采用氫化可的松灌胃建立腎陽(yáng)虛、腎陰虛小鼠模型，通過(guò)觀察各組小鼠精神狀態(tài)等情況，測(cè)定體重，并采用放免法測(cè)定各靶腺軸中激素的含量對(duì)腎虛(腎陽(yáng)虛、腎陰虛)證小鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，為腎陽(yáng)虛、腎陰虛的模型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使該模型的建立及評(píng)價(jià)方法更加完善、嚴(yán)謹(jǐn)，也為提高臨床治療腎虛證的可靠性和適用性提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康KM小鼠90只，雌雄各半，體重(20±2)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(湘)2011-0003】；飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(湘)2013-0005】。采用完全隨機(jī)法將小鼠分為3組，即空白對(duì)照組、腎陰虛模型組、腎陽(yáng)虛模型組，每組30只。

1.1.2 試劑及藥物

氫化可的松注射液(10 mg/2 mL)，安陽(yáng)九州藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：140820001A。促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺激素、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素、促卵泡激素、雌二醇、睪酮放射免疫分析試劑盒，以上試劑盒均由北京北方生物技術(shù)研究所提供(批號(hào)：150820)。

1.1.3 儀器

小型冷凍離心機(jī)(centrifuge 5415R型，德國(guó) Eppendorf公司)；Haier冰箱(bcd-268tn型，青島海爾股份有限公司)；電子天平(Y3002型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立方法

(1)空白對(duì)照組：每天按0.02 mL/g灌胃蒸餾水，自由飲水、飲食，連續(xù)10 d。

(2)腎陽(yáng)虛模型組：每天按25 mg/kg給予灌胃氫化可的松，自由飲水、飲食，連續(xù)10 d。

(3)腎陰虛模型組：每天按0.02 mL/g灌胃蒸餾水，連續(xù)6 d，第7～10 天，按50 mg/kg給予灌胃氫化可的松，自由飲水、飲食，連續(xù)4 d。

1.2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

(1)觀察指標(biāo)

從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，每日觀察小鼠活動(dòng)力、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食、排便及有無(wú)死亡情況等。

(2)測(cè)量指標(biāo)

于造模前、造模后(取材前)分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱(chēng)重，并記錄。

(3)生化指標(biāo)

末次給藥后禁食24 h，于試驗(yàn)第11天摘眼球取血，3500 r/min離心15 min，分離血清，采用放射免疫分析法測(cè)定血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(Cor.)、促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)的含量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對(duì)腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型小鼠生存狀態(tài)的影響

空白對(duì)照組小鼠活動(dòng)自如、反應(yīng)靈敏、毛發(fā)潤(rùn)澤、大便黃褐色，不干不?。荒I陽(yáng)虛模型組小鼠出現(xiàn)精神倦怠、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、肢尾冷、蜷曲拱背、皮毛無(wú)光澤、不欲飲食、大便稀溏等癥狀；腎陰虛模型組小鼠出現(xiàn)煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁易脫落、大便干結(jié)、飲食增多等癥狀。

2.2 對(duì)腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型小鼠體重的影響

與空白對(duì)照組比較，腎陽(yáng)虛模型組、腎陰虛該模型組小鼠體重差異均有顯著性(P<0.01)。提示腎陽(yáng)虛模型小鼠及腎陰虛模型小鼠體重均降低。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 對(duì)腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型小鼠HPA軸中ACTH、Cor.含量的影響

與空白對(duì)照組比較，腎陽(yáng)虛模型、腎陰虛模型組小鼠血清ACTH、Cor.含量均有顯著性差異(P<0.01)；提示腎陽(yáng)虛模型小鼠血清ACTH、Cor.含量均降低，而腎陰虛模型小鼠則反之，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 對(duì)腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型小鼠HPT軸中TSH、T3、T4含量的影響

與空白對(duì)照組比較，腎陽(yáng)虛模型、腎陰虛模型組

小鼠血清TSH、T3、T4含量均有顯著性差異(P<0.01)；提示腎陽(yáng)虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量均降低，而腎陰虛模型小鼠則反之，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 對(duì)糖皮質(zhì)激素腎陽(yáng)虛模型小鼠及腎陰虛模型小鼠體重的影響±s)Fig.1 Effect of body weight of kidney-yang and kidney-yin deficiency mice induced by oral administration of hydrocortisone

表1 對(duì)小鼠血清ACTH、Cor.及TSH、T3、T4含量的影響

注：與空白組比，**P<0.01(表2同)。

Note.**P<0.01, compared with the blank group. (The same as the Tab. 2)

2.5 對(duì)腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型小鼠HPG軸中FSH、E2、T含量的影響

與空白對(duì)照組比較，腎陽(yáng)虛模型、腎陰虛模型組小鼠血清FSH含量差異均有顯著性(P<0.01)；雌鼠血清E2含量差異有顯著性(P<0.01)，但雄鼠差異無(wú)顯著性；雄鼠血清T含量差異有顯著性(P<0.01)，但雌鼠差異無(wú)顯著性。提示腎陽(yáng)虛模型、腎陰虛模型組小鼠均存在HPG軸功能紊亂，且不同性別的小鼠性激素也具有不同的表現(xiàn)，腎陽(yáng)虛模型小鼠血清FSH含量升高，雌鼠血清E2含量及雄鼠血清T含量升高，而腎陰虛模型小鼠血清FSH含量降低，雌鼠血清E2含量及雄鼠血清T含量降低，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)小鼠血清FSH、E2、T含量的影響

3 討論

腎虛是常見(jiàn)的中醫(yī)臨床體質(zhì)之一，是以腎中精氣虛損，機(jī)體表現(xiàn)以腎的臟腑的功能低下為主要特征的一種生理狀態(tài)。目前主要通過(guò)藥物致內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)功能紊亂的方法建立腎虛證動(dòng)物模型，其中多采用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物(氫化可的松)來(lái)造模，而氫化可的松所使用的給藥劑量、持續(xù)天數(shù)不同，可分別復(fù)制出腎陽(yáng)虛和腎陰虛模型。大劑量外源性皮質(zhì)激素早期能使機(jī)體呈煩躁多動(dòng)等腎陰虛表現(xiàn)[8]，但由于腎上腺皮質(zhì)激素可使促腎上腺皮質(zhì)激素釋放受抑制，而使類(lèi)固醇激素分泌減少，所以出現(xiàn)一系列“耗竭”現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)“陰損及陽(yáng)”的轉(zhuǎn)變，特別是突然停用，腎上腺軸的抑制狀態(tài)立即暴露，出現(xiàn)一系列腎陽(yáng)虛的表現(xiàn)[9]。

目前報(bào)道的腎虛模型多采用肌肉或皮下注射氫化可的松造模，而筆者前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)肌肉或皮下注射后死亡率過(guò)高，故本實(shí)驗(yàn)改用灌胃給藥造模，該方法操作簡(jiǎn)便，成功率高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同劑量的氫化可的松灌胃不同時(shí)間造模后，腎陽(yáng)虛模型小鼠出現(xiàn)體重下降，活動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、肢尾冷，卷曲拱背，皮毛無(wú)光澤、不欲飲食等癥狀；腎陰虛模型小鼠出現(xiàn)體重下降，煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁易脫落、大便干結(jié)、飲食增多等癥狀，這與過(guò)去報(bào)道的腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型的癥狀體征基本一致[10]。

也有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)腎虛者內(nèi)分泌系統(tǒng)各激素水平發(fā)生了一定程度的紊亂，并通過(guò)觀察HPA軸中的ACTH、Cor.含量，HPG軸中的FSH、E2、T含量或HPT軸中TSH、T3、T4的含量的變化來(lái)判斷腎陽(yáng)虛和腎陰虛[11-13]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛模型小鼠血清ACTH、Cor.、TSH、T3、T4水平降低，血清FSH、E2、T水平升高，而腎陰虛模型則反之，這進(jìn)一步證明腎虛小鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)中各激素水平均發(fā)生紊亂。而糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮)是由腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生和分泌的激素，在體內(nèi)主要發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用。皮質(zhì)醇(Cor.)的分泌依賴(lài)于HPA軸的分泌規(guī)律，受垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素的控制，Cor.的合成量不足或分泌過(guò)多均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)糖代謝紊亂，故血清中Cor.的水平高低是反映腎上腺皮質(zhì)功能的重要指標(biāo)[14-15]。腎陽(yáng)虛者大多表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能抑制，腎陰虛者反之，因此Cor.可用于評(píng)價(jià)腎虛模型的成功與否，尤其是對(duì)于采用糖皮質(zhì)激素法建立的腎虛模型，這為中醫(yī)腎陽(yáng)虛、腎陰虛模型的成功建立及相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Establishment of a mouse model of kidney deficiency induced by oral administration of hydrocortisone and evaluation of related factors

DAI Bing1, ZHANG Jia-ni2, YANG Meng-lin2, LI Yu-xing2, XIAO Zi-zeng2*, YANG Lei1, WEI Qiang1

(1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China；2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208)

Objective To establish a mouse model of kidney-yin and kidney-yang deficiency after oral administration of hydrocortisone, and to explore the related evaluation factors.Methods The model was established by oral administration of hydrocortisone to induce kidney-yin and kidney-yang deficiency in mice. The survival and body weight of the mice were observed. The serum content of adrenal cortical hormone (ACTH), cortisol (Cor.) in the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, and thyroid stimulating hormone (TSH), triiodothyronine (T3), thyrox (T4) in the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis, follicle-stimulating hormone (FSH), estradiol (E2), testosterone (T) in the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis were determined by radioimmunoassay.Results The body weight of kidney-yin and kidney-yang mice were decreased, the serum ACTH, Cor, TSH, T3, T4 contents were decreased, the serum FSH, E2, T contents were increased in the kidney-yang deficiency model mce (P<0.01), and those parameters in the kidney-yin deficiency model mice were changed in opposite direction. Conclusions It is found that the hormone levels of ACTH, Cor, TSH, T3, T4, FSH, E2 and T in kidney deficiency mice are changed, and cortisol can be used as an important index to evaluate the model of kidney deficiency induced by glucocorticoid.

Kidney-yang deficiency; Kidney-yin deficiency; Evaluating factors; Mouse models

XIAO Zi-zeng， E-mail: 1092341361@qq.com

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：15A140);湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生科研創(chuàng)新課題(編號(hào)：2016CX16)。

戴冰(1965-)，女，主任藥師，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥炮制、藥理學(xué)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: db0223@163.com

肖子曾(1959-)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：方劑的應(yīng)用及療效機(jī)理研究。E-mail: 1092341361@qq.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0070-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.013

2016-06-13