李俊，葉亮，王帆

體外血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移力的影響

李俊，葉亮，王帆

目的：在體外觀察血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單克隆抗體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移力的影響。方法：采用氯化鈷（CoCl2）模擬缺氧環(huán)境，予以0、0.1、1、10 μg/mL的VEGF抗體，對常氧或缺氧條件下對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行處理。通過MTT實驗檢測細(xì)胞增殖，Transwell實驗檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力，Western blotting檢測HIF-1α蛋白、FAK/Pyk2總蛋白及磷酸化FAK-Tyr397/Pyk2-Tyr402表達(dá)水平變化。結(jié)果：200 μmol/L CoCl2明顯抑制C6細(xì)胞增殖（P＜0.05），10 μg/mL VEGF抗體可明顯抑制C6細(xì)胞增殖（P＜0.05）。與常氧相比，缺氧可使C6細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強(qiáng)（P＜0.05）。常氧和缺氧下，VEGF抗體的干預(yù)均增強(qiáng)C6細(xì)胞的遷移、侵襲能力（P＜0.05），且相對于常氧，缺氧可進(jìn)一步增強(qiáng)VEGF抗體促C6細(xì)胞遷移、侵襲的作用（P＜0.05）。CoCl2干預(yù)可增加C6細(xì)胞中HIF-1α的含量；在常氧和缺氧情況下，只有1 μg/mL VEGF抗體可降低FAK的總蛋白量（P＜0.05）；在缺氧情況下，VEGF抗體可明顯增高Pyk2-Tyr402位點的磷酸化水平。結(jié)論：在缺氧情況下，VEGF抗體的干預(yù)可使Pyk2-Tyr402位點的磷酸化水平增高，引起C6細(xì)胞的侵襲遷移能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；遷移；侵襲；缺氧；血管內(nèi)皮生長因子

膠質(zhì)瘤大約占顱腦腫瘤的70%以上，是最為常見的原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其中多形性膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）被認(rèn)為是最惡性的膠質(zhì)瘤（WHOⅣ級）[1,2]。針對新確診的膠質(zhì)瘤，目前主要采取以手術(shù)、放療、化療為主的綜合治療方案，但其預(yù)后不容樂觀，確診后平均生存期僅為14月[3,4]，而且大部分腫瘤會復(fù)發(fā)，對于復(fù)發(fā)型膠質(zhì)瘤目前仍未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。本研究采用化學(xué)方法建立膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺氧模型[5,6]，觀察血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響，并初步探討缺氧環(huán)境下，VEGF抗體對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移能力改變的有關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。C6細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃的密閉培養(yǎng)箱內(nèi)（培養(yǎng)箱相對濕度為95%），每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%密度時，予以傳代。

1.1.2 主要試劑 氯化鈷（CoCl2）、丙烯酰胺/N、N-亞甲叉雙丙烯酰胺（Arc/Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、甘氨酸（Glycine）購于美國Sigma公司；Tween-20、β-巰基乙醇購于美國Amresco公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒購于美國Pierce公司；FAK/p-FAK（Tyr397）抗體、Pyk2/p-Pyk2（Tyr402）抗體、VEGF單克隆抗體、β-actin抗體、HRP標(biāo)記的二抗購于美國Santa Cruz公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度CoCl2對C6細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞，消化、吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后以每孔8×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)置5個復(fù)孔，于37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞生長至60%～70%時棄去原培養(yǎng)基，每孔加入含有不同濃度CoCl2的培養(yǎng)基200 μL，使CoCl2終濃度分別為0 μmol/L（0 μmol/L組）、50 μmol/L（50 μmol/L組）、100 μ mol/L（100 μ mol/L組）、200 μ mol/L（200 μmol/L組），調(diào)零孔加入與實驗組等體積的培養(yǎng)基，其余邊緣孔加入等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)；處理24 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，于37℃溫箱中孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200 μL二甲基亞砜（DMSO），將培養(yǎng)板放在水平搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；以空白孔調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm波長處的每孔吸光度值（OD值），比較細(xì)胞活力改變。

1.2.2 不同濃度VEGF抗體對C6細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞，消化、吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后以每孔8×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞生長至60%～70%時棄去原培養(yǎng)基，每孔加入含有不同濃度VEGF抗體的常氧或缺氧培養(yǎng)基200 μL，使VEGF抗體終濃度分別為0 μg/mL（0 μg/mL組）、0.1 μg/mL（0.1 μg/mL組）、1 μg/mL（1 μg/mL組）、10 μ g/mL（10 μ g/mL組），缺氧條件培養(yǎng)基中含100 μmol/L CoCl2，常氧條件培養(yǎng)基則不含CoCl2，調(diào)零孔加入與實驗組等體積的培養(yǎng)液，其余邊緣孔加入等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)；處理24 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，于37℃溫箱中孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，將培養(yǎng)板放在水平搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；以空白孔調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm波長處的每孔OD值，比較細(xì)胞活力改變。

1.2.3 Transwell體外遷移和侵襲實驗 取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞，消化、吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后以每孔1× 105個接種細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，于37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；參照文獻(xiàn)方法[7,8]進(jìn)行體外遷移和侵襲實驗，在倒置顯微鏡下觀察，200×視野下任取5個不重復(fù)視野照相，并記數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4Western Blotting檢測FAK、Pyk2總蛋白表達(dá)變化及其磷酸化水平的變化 按照試劑盒說明步驟制備蛋白樣品，根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度在Excel中計算出直線回歸方程，再根據(jù)蛋白樣品OD值，用回歸方程計算出樣品蛋白濃度及上樣量。按照試劑盒說明進(jìn)行Western Blotting檢測，photoshop CS 5和Image J軟件處理分析圖片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析及制圖采用SPSS 17.0、Image J、photoshop CS 5、Excel 2003軟件完成，方差分析、t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的CoCl2對C6細(xì)胞增殖的影響

加入CoCl2后，50、100、200 μmol/L組的C6細(xì)胞的相對活性分別為（1.00±0.00）、（0.94±0.08）、（0.89±0.07）、（0.56±0.05）。50 μmol/L組和100 μmol/L組的C6細(xì)胞的相對活性與0 μmol/L組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，200 μmol/L組的C6細(xì)胞的相對活性較0 μmol/L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），C6細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞變細(xì)，突起減少，粘附性下降。

2.2 不同濃度的CoCl2對C6細(xì)胞HIF-1α的影響

CoCl2可引起HIF-1α表達(dá)增高，而且100 μmol/L組的HIF-1α的增高更顯著，見圖1。

圖1 Western blotting檢測不同濃度CoCl2對C6細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響

2.3 常氧/缺氧條件下VEGF抗體對C6細(xì)胞增殖的影響

給予VEGF抗體后，無論是在常氧還是缺氧條件下，0.1 μg/mL組和1 μg/mL組C6細(xì)胞的相對活性與0 μg/mL組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10 μg/ mL組C6細(xì)胞的相對活性與0 μg/mL組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制，見表1。

表1 常氧或缺氧情況下VEGF抗體對C6細(xì)胞增殖活性的影響（±s）

表1 常氧或缺氧情況下VEGF抗體對C6細(xì)胞增殖活性的影響（±s）

注：與0 μg/mL組比較，①P＜0.05

組別0 μg/mL組0.1 μg/mL組1 μg/mL組10 μg/mL組細(xì)胞相對活性常氧1.00±0.00 1.02±0.10 1.03±0.10 0.89±0.08①缺氧1.00±0.00 1.03±0.11 1.06±0.10 0.86±0.07①

2.4 常氧/缺氧條件下VEGF抗體對C6細(xì)胞遷移的影響

常氧和缺氧時，VEGF抗體的干預(yù)使C6細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，與0 μg/mL組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0 μg/mL組缺氧情況下的C6細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)，較常氧情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.1、1 μg/mL組缺氧情況下的C6細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 常氧或缺氧情況下VEGF抗體對C6細(xì)胞遷移的影響（±s）

表2 常氧或缺氧情況下VEGF抗體對C6細(xì)胞遷移的影響（±s）

注：與0 μg/mL組常氧比較，①P＜0.05；與0 μg/mL組缺氧比較，②P＜0.05；與0.1 μg/mL組常氧比較，③P＜0.05；與1 μg/mL組常氧比較，④P＜0.05

組別0 μg/mL組0.1 μg/mL組1 μg/mL組遷移細(xì)胞數(shù)常氧61.28±5.96 98.72±9.65①114.68±10.59①缺氧96.69±9.42①152.35±14.64②③162.85±15.36②④

圖2 常氧或缺氧情況下的VEGF抗體對C6細(xì)胞遷移的影響（×200）

2.5 常氧/缺氧條件下VEGF抗體對C6細(xì)胞侵襲的影響

在常氧情況下，0.1 μg/mL組和1 μg/mL組的C6細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；0 μg/mL組的C6細(xì)胞在缺氧情況下較常氧更具有侵襲力（P＜0.05），0.1 μg/ mL組和1 μg/mL組的C6細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），且強(qiáng)于常氧情況（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 常氧或缺氧情況下VEGF抗體對C6細(xì)胞侵襲的影響（±s）

表3 常氧或缺氧情況下VEGF抗體對C6細(xì)胞侵襲的影響（±s）

注：與0 μg/mL組常氧比較，①P＜0.05；與0 μg/mL組缺氧比較，②P＜0.05；與0.1 μg/mL組常氧比較，③P＜0.05；與1 μg/mL組常氧比較，④P＜0.05

組別0 μg/mL組0.1 μg/mL組1 μg/mL組遷移細(xì)胞數(shù)常氧48.28±4.54 98.45±8.69①102.46±9.65①缺氧69.35±6.24①181.59±16.32②③205.68±18.96②④

圖3 常氧/缺氧情況下的VEGF抗體對C6細(xì)胞侵襲的影響（× 200）

2.6 常氧/缺氧條件下VEGF抗體對C6細(xì)胞FAK、Pyk2磷酸化的影響

在常氧和缺氧情況下，0.1 μg/mL組的FAK總蛋白表達(dá)無變化，1 μg/mL組的FAK總蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；此外，單純的缺氧處理未能使FAK總蛋白表達(dá)改變，而在缺氧情況下，1 μg/mL組的C6細(xì)胞的FAK總蛋白表達(dá)較常氧情況增高（P＜0.05）；缺氧和VEGF抗體的干預(yù)均未使得FAK-Tyr397自身磷酸化水平發(fā)生改變。在常氧及缺氧情況下，不同濃度VEGF抗體處理后，Pyk2總蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在常氧情況下，不同濃度VEGF抗體處理未引起Pyk2-Tyr402磷酸化水平改變；而在缺氧環(huán)境下，0.1 μg/mL組和1 μg/ mL組的C6細(xì)胞的Pyk2-Tyr402磷酸化水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4、表4。

3 討論

在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的HIF-α極不穩(wěn)定，數(shù)分鐘之內(nèi)就會被泛素蛋白酶體（ubiquitin-proteasome path-way）降解，而在缺氧環(huán)境下，HIF-1α?xí)D(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與HIF-1β亞單位結(jié)合，參與相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在各種模擬細(xì)胞缺氧的實驗方法之中，CoCl2模擬缺氧環(huán)境應(yīng)用得較為廣泛。CoCl2可抑制HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)的降解，導(dǎo)致HIF-1α堆積，繼而模擬缺氧環(huán)境。由于Co-Cl2對細(xì)胞有一定的毒性作用，本研究評估CoCl2對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。MTT實驗結(jié)果顯示，當(dāng)CoCl2作用濃度波動于100 μmol/L以下時，C6細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的增殖抑制；當(dāng)CoCl2作用濃度達(dá)到200 μmol/L時，C6細(xì)胞的相對活性明顯下降，出現(xiàn)增殖抑制，與之前的報道基本吻合[9,10]。Western blotting結(jié)果示，正常細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有一定量的HIF-1α；以50 μmol/L的CoCl2處理C6細(xì)胞時，HIF-1α的含量增加；CoCl2達(dá)100 μmol/ L時，HIF-1α的含量更高。結(jié)合既往研究[10]，本研究認(rèn)為100 μmol/L的CoCl2處理細(xì)胞12～24 h后，會引起HIF-1α過度表達(dá)，較適合用于模擬體外缺氧。因此，后續(xù)試驗中采取100 μmol/L的CoCl2處理C6細(xì)胞模擬缺氧環(huán)境。

表4 常氧/缺氧條件下VEGF抗體對C6細(xì)胞FAK、Pyk2磷酸化的影響（±s）

表4 常氧/缺氧條件下VEGF抗體對C6細(xì)胞FAK、Pyk2磷酸化的影響（±s）

注：與0 μg/mL組常氧比較，①P＜0.05；與0 μg/mL組缺氧比較，②P＜0.05；與1 μg/mL組常氧比較，③P＜0.05

組別0 μg/mL組0.1 μg/mL組1 μg/mL組FAK蛋白常氧0.92±0.08 0.83±0.06 0.34±0.02①缺氧1.22±0.10 1.24±0.11 0.96±0.08②③FAK磷酸化常氧0.96±0.09 0.91±0.08 0.99±0.08缺氧0.89±0.08 0.90±0.09 0.92±0.08 Pyk2蛋白常氧0.45±0.04 0.47±0.03 0.46±0.04缺氧0.43±0.04 0.46±0.03 0.44±0.04 Pyk2磷酸化常氧1.26±0.12 1.42±0.14 1.51±0.15缺氧1.46±0.14 1.96±0.18 1.98±0.19①③

圖4 Western blotting檢測常氧或缺氧情況下VEGF抗體對C6細(xì)胞FAK和Pyk2總蛋白及其磷酸化水平的影響

既往研究[11]已證實，VEGF/VEGFR-2信號通路的激活可趨化內(nèi)皮細(xì)胞增殖。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，VEGFR-2僅存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中?，F(xiàn)有的研究[12]則對這一觀點提出質(zhì)疑，認(rèn)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也存在VEGFR-2，膠質(zhì)瘤細(xì)胞所分泌的VEGF不僅結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的VEGFR-2，而且也以自分泌的方式，結(jié)合腫瘤細(xì)胞自身的VEGFR-2，這被認(rèn)為與膠質(zhì)瘤的治療抵抗密切相關(guān)。Knizetova等[13]運(yùn)用VEGFR-2抑制劑（SU1498）阻斷星形細(xì)胞瘤的這一自分泌信號通路，抑制星形細(xì)胞瘤的生長，且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對電離輻射的敏感性，認(rèn)為c-Raf/MAPK、PI3K/Akt和PLC/PKC均參與調(diào)控這一通路的激活。既往研究表明[14,15]，F(xiàn)AK/Pyk2與膠質(zhì)瘤的遷移、侵襲行為密切相關(guān)。其中，F(xiàn)AK涉及細(xì)胞周期和細(xì)胞生存的調(diào)節(jié)，F(xiàn)AK激活后以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖為主，在敲除Pyk2的細(xì)胞中FAK激活并不能促進(jìn)細(xì)胞遷移，反而對細(xì)胞遷移具有一定的抑制作用；Pyk2激活以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲為主，對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖有負(fù)向調(diào)節(jié)作用；FAK和Pyk2之間的平衡是膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的重要調(diào)節(jié)因素。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)100 μmol/L的CoCl2在12 h內(nèi)造成C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF-1α的堆積，且未造成細(xì)胞毒性，因此可用于模擬C6細(xì)胞的體外缺氧。在常氧及缺氧情況下，VEGF抗體未對C6細(xì)胞的增殖活性造成影響，但可增強(qiáng)C6細(xì)胞的侵襲遷移能力。在常氧及缺氧情況下，VEGF抗體未通過改變FAK-Tyr397位點的磷酸化水平來影響C6細(xì)胞的增殖活性。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力變化是由多個因素調(diào)控的病理生理過程，在常氧情況下，VEGF抗體未改變C6細(xì)胞Pyk2-Tyr402位點的磷酸化水平。而在缺氧情況下，VEGF抗體的干預(yù)可使Pyk2-Tyr402位點的磷酸化水平增高，引起C6細(xì)胞的侵襲遷移能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

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（本文編輯：王晶）

Effect of VEGF Monoclonal Antibody on Proliferation,Invasion and Migration of C6 Glioma Cellsin vitro

LI Jun,YE Liang,WANG Fan.Department of Neurosurgery,Mianyang 404 Hospital,Sichuan 621000,China

Objective:To observe the effect of vascular endothelial growth factor(VEGF)monoclonal antibody on C6 glioma cells’proliferation,migration and invasionin vitro.Methods:CoCl2was added in culture medium to imitate hypoxic culture condition.C6 glioma cells were treated by VEGF antibody with different concentrations(0.1 μg/mL and 1 μg/mL)under normoxic or hypoxic conditions.Cell proliferation was detected by MTT assay.The ability of cell migration and invasion were evaluated by Transwell testing assay.The expression of HIF-1α protein,FAK/Pyk2 total protein and level of FAK-Tyr397/Pyk2-Tyr402 phosphorylation were detected by Western blot.Results:Treatment with 200 μmol/L CoCl2significantly inhibited the proliferation of C6 glioma cells(P＜0.05).10 μg/mL VEGF antibody significantly inhibited the proliferation of C6 glioma cells(P＜0.05).Compared to the normoxic condition,hypoxiia increased the migration and invasion of C6 cells(P＜0.05). Under the normoxic and hypoxic condition,the VEGF antibody can increase the migration and invasion of C6 (P＜0.05).Compared to the normoxic condition,hypoxia can enhance the migration and invasion by VEGF antibody to C6 cell(P＜0.05).The expression of total FAK protein was decreased in C6 cells by VEGF antibody only in the 1μg/ml concentration(P＜0.05).Under hypoxic condition,the phosphorylation levels of Pyk2-Tyr402 was increased in C6 cells after VEGF antibody treatment(P＜0.05).Conclusion:Under hypoxic condition,VEGF antibody can increase the phosphorylation levels of Pyk2-Tyr402,which contribute to the invasion and migration of C6 cells.

glioblastoma;migration;invasion;hypoxic;vascular endothelial growth factor(VEGF)

R741;R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.01.002

綿陽市404醫(yī)院神經(jīng)外科四川綿陽621000

中華醫(yī)學(xué)會臨床醫(yī)學(xué)科研專項資金（No.12020600360）

2015-11-13

李俊gdhuanghb@163. com