張 彥 夏慧敏

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在兒外科出生缺陷疾病譜中的應(yīng)用

張 彥 夏慧敏

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是以個性化醫(yī)療為基礎(chǔ)，隨著全基因組測序技術(shù)及生物信息學(xué)的交叉應(yīng)用而發(fā)展起來的新興醫(yī)學(xué)模式。復(fù)雜遺傳病的不同臨床表型都是個體基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀遺傳學(xué)因素等綜合作用的結(jié)果。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)根據(jù)導(dǎo)致疾病的潛在遺傳因子對疾病進(jìn)行診斷和分類，而非傳統(tǒng)的根據(jù)癥狀和體征對疾病分類的方法，從而出現(xiàn)了罹患同種疾病的“個性化差異”模式。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容是基因的檢測，通過先進(jìn)的基因檢測技術(shù)，如全基因組測序、外顯子測序和轉(zhuǎn)錄組測序等，發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生相關(guān)的致病基因。因此，基因測序是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)和靈魂。

一、DNA測序技術(shù)的發(fā)展及新一代測序技術(shù)的興起

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是遺傳信息的基本載體，決定了生命的延續(xù)、個體生存，甚至物種的進(jìn)化。新一代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）應(yīng)運而生，高通量，測序速度快，成本低，生成海量數(shù)據(jù)。這些優(yōu)勢使得NGS近年來被廣泛運用在基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，對一種疾病不同狀態(tài)和過程進(jìn)行精確亞分類，精確尋找疾病的原因和治療的靶點，并為解釋疾病的發(fā)病機制開辟了新路徑。伴隨測序技術(shù)的發(fā)展，測序技術(shù)的突破不僅推動了生物學(xué)的發(fā)展，還使得那些在基礎(chǔ)生物學(xué)研究領(lǐng)域取得的成果，能夠成功運用于臨床，并將在疾病的預(yù)防控制，快速臨床診斷，個性化治療等方面起到重要的作用。

二、兒外科常見出生缺陷精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用進(jìn)展我國在出生缺陷的診療研究上有了一定的進(jìn)展。近年來迅速發(fā)展起來的基因診斷技術(shù)，在出生缺陷與遺傳病檢測領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。

1.先天性心臟?。合忍煨孕呐K?。╟ongenital heart disease，CHD）是引起我國新生兒死亡的主要原因之一［1］。其病因復(fù)雜，絕大多數(shù)是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。部分CHD臨床亞型與染色體異常有關(guān)，如22q11缺失、21號染色體三倍型等［2］。此外，迄今為止超過50個基因與CHD密切相關(guān)。CHD相關(guān)突變大部分落在一小組發(fā)育基因（例如NKX2－5，GATA4，和NOTCH1）［2］。小鼠模型研究表明，超過500種基因可誘發(fā)心臟缺陷?？上攵祟怌HD致病基因廣泛存在。

我國目前對胎兒染色體非整倍體異常篩查的技術(shù)成熟度較高［3］，仍有較大部分CHD病人無法做到產(chǎn)前診斷。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，從全基因組遺傳變異層面，國內(nèi)外在CHD遺傳致病位點有大量前期研究，如MTHFR c.677 C＞T、c.1298 A＞C、MTRR c.66 A＞G等被證實［4］。Zaidi等［5］利用362例復(fù)雜CHD病人和264例對照，通過全基因組測序技術(shù)證實了一系列與His3Lys4甲基化密切相關(guān)的新發(fā)突變。Turki等［6］利用外顯子測序檢測了13個胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常（AVSD）核心家系和112個散發(fā)對照，證實了高保守性NR2F2多個罕見錯義突變，小鼠模型證實NR2F2與心臟發(fā)育過程的動脈生成有關(guān)；后續(xù)收集CHD家系證實了NR2F2區(qū)域更多的結(jié)構(gòu)變異。盡管有上述各項成功的案例，并不是所有研究都能成功找到致病基因。Arrington等［7］采集有明確的常染色體顯性遺傳模式的11個不同CHD臨床表型患者的四代家系，利用全外顯子組測序技術(shù)挖掘其致病基因；然而出人意料的是，不同臨床亞型的家族成員并未確認(rèn)共同的致病位點。Martin等［8］利用全外顯子測序技術(shù)檢測共17人的先天性兩葉型主動脈瓣（BAV）大家系，其中BAV病例3例，其他心血管畸形3例；然而并未有明確的致病變異確證。

上述案例顯示僅有部分病例符合孟德爾遺傳規(guī)律。遺傳變異的頻率和變異對疾病表型的貢獻(xiàn)度或外顯率成正比，高頻率的遺傳變異的效應(yīng)值（odds ratio，OR）較低，因此對表型的貢獻(xiàn)度或外顯率（penetrance）較??；低頻率的遺傳變異的效應(yīng)值較高，因此對疾病的貢獻(xiàn)度或外顯率較大［10］。因此，國內(nèi)外研究人員一致認(rèn)為除致病突變以外，針對不同CHD臨床亞型存在一系列效應(yīng)值中等的易感變異。2013年Cordell等［9］利用全基因組基因分型技術(shù)，基于835例法洛四聯(lián)癥患者和5 159例健康對照證實12q24和13q32為遺傳易感基因；同年，Cordell等［10］利用相同的技術(shù)，基于1 995例復(fù)雜CHD患者（主要涵蓋中隔、梗阻性和紫紺型缺陷）挖掘遺傳易感基因，遺憾的是當(dāng)各種臨床亞型混在一起，并未有任何易感基因證實；而進(jìn)一步按臨床亞型聚類分析研究確證4p16與繼發(fā)孔型房間隔缺損（ASD）易感，且在后續(xù)417例ASD病人和2 520例對照中進(jìn)一步得到驗證。

上述多個研究表明CHD不同臨床表型的遺傳機制確有不同，在后續(xù)研究中需進(jìn)一步細(xì)化臨床表型，相互佐證又相互區(qū)別地對待才能從中抽絲剝繭，確認(rèn)真正的致病遺傳機制。故而在后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化研究中，應(yīng)以臨床標(biāo)本為本，進(jìn)一步細(xì)化研究。

本中心側(cè)重于收集有明顯臨床特征的復(fù)雜型且預(yù)后較差的CHD病患，擬建立長期隨訪隊列，對不同臨床亞型的CHD進(jìn)行聚類分析，利用NGS，包括全基因組甲基化測序、轉(zhuǎn)錄組測序等挖掘致病因素和潛在治療的靶點；并進(jìn)一步根據(jù)預(yù)后個體差異，建立不同的預(yù)警、治療方案對疾病進(jìn)行有效診斷和干預(yù)。本中心科研人員前期利用新生兒心胸外科部分復(fù)雜CHD患者的共同臨床特征：胸腺切除展開研究，回顧胸腺切除后對患兒免疫系統(tǒng)的影響，對術(shù)后不同時間段的病人進(jìn)行外周血免疫細(xì)胞分選，選擇恢復(fù)期特異富集免疫細(xì)胞，利用全基因組甲基化測序技術(shù)確定CpG點甲基化與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，擬建立疾病特有的甲基化圖譜或生物標(biāo)記物。并進(jìn)一步在免疫細(xì)胞衰老程度、胸腺切除病人特異性標(biāo)記物篩查等方向展開多方面探討。希望能從契合臨床的視角為CHD的研究添磚加瓦。

2.消化道畸形：消化道畸形是新生兒期常見的畸形之一，常見病種包括：食管閉鎖、肥厚性幽門狹窄、腸閉鎖、先天性巨結(jié)腸、肛門閉鎖、膽總管囊腫、膽道閉鎖等。國外統(tǒng)計其發(fā)生率約為3‰，國內(nèi)新生兒科統(tǒng)計約占同期住院新生兒的1‰。在臨床診療技術(shù)得到大力發(fā)展的同時，科學(xué)家們?nèi)岳^續(xù)在基礎(chǔ)研究方面探索該類疾病的病因及發(fā)病機制，并尋求更先進(jìn)可靠的診療方法。

以先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung disease，HSCR）為例，其是新生兒期低位腸梗阻常見原因之一。普遍認(rèn)為遺傳因素在先天性巨結(jié)腸的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。目前發(fā)現(xiàn)RET內(nèi)多個位點突變可以解釋約30%～50%的家族性和20%的散發(fā)性先天性巨結(jié)腸發(fā)病原因。然而，目前發(fā)現(xiàn)先天性巨結(jié)腸的突變位點在不同家系中極為分散，無熱點區(qū)域存在，極少數(shù)為大片段缺失，多為點突變，錯義，無義，移碼突變［11－17］。已知RET有4種配體，分別是膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng) 營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白（NRTN）、artemin（ARTN）、persephin（PSPN），它們與GDNF家族受體結(jié)合后與RET結(jié)合形成復(fù)合物，激活RET信號通路。該通路對于腸神經(jīng)系統(tǒng)的分化、發(fā)育和成熟至關(guān)重要［18］。GDNF突變常見于綜合征型先天性巨結(jié)腸，突變率為0.9%～5.5%。目前已經(jīng)檢測到多個功能突變與先天性巨結(jié)腸相關(guān)［19］。NRTN亦發(fā)現(xiàn)有限的功能突變與先天性巨結(jié)腸相關(guān)［20，21］。

然而上述配體發(fā)現(xiàn)均存在外顯率較低的現(xiàn)象，且往往與RET的功能突變分離。上述突變可能與RET的突變存在相互作用，能夠影響先天性巨結(jié)腸的臨床癥狀，而與其發(fā)病本身相關(guān)性較低。

雖然RET信號通路被廣泛認(rèn)為是與先天性巨結(jié)腸發(fā)病最為密切的通路，然而由于先天性巨結(jié)腸發(fā)病率較低，已知致病突變多來源于獨立家系報道，針對該通路中的致病遺傳突變尚未有系統(tǒng)性的群體研究，缺乏系統(tǒng)性的篩查總結(jié)指導(dǎo)臨床診斷、治療。隨著高通量基因分型技術(shù)的廣泛應(yīng)用，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）被逐漸運用在包括先天性巨結(jié)腸在內(nèi)的各種復(fù)雜疾病易感基因的發(fā)掘。2008年Garcia-Barcelo等首次證實NRG1為先天性巨結(jié)腸的易感基因［22］；2012年Tang等發(fā)現(xiàn)NRG3中11個新發(fā)結(jié)構(gòu)突變被證實與先天性巨結(jié)腸相關(guān)［23］。證實在先天性巨結(jié)腸散發(fā)病例存在較家系中發(fā)現(xiàn)的罕見突變而言外顯率較低的易感基因。2014年，Kim等又提出了SLC6A20、RPRA、ABCC9等多個潛在易感基因［24］。2016年，相同的研究團隊基于SLC6A20的潛在易感位點進(jìn)行精細(xì)定位提出SLC6A20多個潛在易感位點［25］。

雖然分子遺傳學(xué)取得了如上述巨大進(jìn)展，但仍不能完全解釋先天性巨結(jié)腸的起因，術(shù)后提示尚有多種未發(fā)現(xiàn)的遺傳因素。特別是基于不同人群中的群體遺傳易感機制篩查，寥寥無幾，故而有待后續(xù)挖掘。但具體如何利用致病基因指導(dǎo)臨床診斷、治療，尚未有定論。本中心兒外科科研人員基于已知、新證、潛在先天性巨結(jié)腸遺傳致病基因或區(qū)域，利用目標(biāo)區(qū)域測序技術(shù)構(gòu)建遺傳診斷數(shù)據(jù)庫；針對已知的致病突變攜帶者，我們準(zhǔn)備根據(jù)其所攜帶的致病突變劃分類型進(jìn)而進(jìn)行更深入的致病基因遺傳機制研究；針對攜帶未知致病突變的樣本，我們將在后續(xù)挖掘全新致病基因中進(jìn)一步篩選。此外，基于單中心收集巨結(jié)腸家系樣本組，利用全基因組測序技術(shù)挖掘新發(fā)突變、罕見突變，證實全新先天性巨結(jié)腸遺傳基因?；谏鲜龉ぷ鳎瑖@已知致病基因和全新挖掘出的致病基因，擬制備先天性巨結(jié)腸遺傳診斷芯片，為臨床診斷提供更為有效的證據(jù)，并為針對先天性巨結(jié)腸病人的個性化醫(yī)療提供助益。

三、出生缺陷隊列的建立及生物標(biāo)本的存儲

誠然，基于先天性心臟病、先天性巨結(jié)腸本中心展開了一系列遺傳機制的臨床轉(zhuǎn)化研究。但出生缺陷的預(yù)防、診斷和治療依然面臨諸多挑戰(zhàn)。眾所周知，出生缺陷的發(fā)生是一個動態(tài)的過程，在此期間發(fā)生的許多獨立事件都可能是致病的協(xié)同作用。單純針對某一時間點的臨床樣本進(jìn)行后續(xù)研究可能會有失偏頗。而隊列研究可觀察多個因素的多種臨床效應(yīng)，這正是隊列法不可取代的用途，為疾病個體的精準(zhǔn)化醫(yī)療提供了更為詳實的病程記錄。本中心基于先天性心臟病、先天性巨結(jié)腸已有前期研究基礎(chǔ)的疾病建立大樣本出生缺陷隊列。目前已建立前瞻性出生隊列公共平臺［26］，隊列中健康人群的已逐步生成多組學(xué)數(shù)據(jù)，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組和腸道菌群的宏基因組數(shù)據(jù)，可以綜合、立體、量化反映個體健康狀態(tài)，也可以成為各類疾病研究無可替代的黃金對照。給疾病的發(fā)生發(fā)展提供了重要的溯源研究資源，也為系統(tǒng)地、多時點地描述疾病的發(fā)展提供了可能，同時通過將生物樣本庫中的組學(xué)信息與流行病學(xué)數(shù)據(jù)、電子病歷系統(tǒng)進(jìn)行整合匹配，為先天性心臟病、先天性巨結(jié)腸提供更細(xì)致的定義疾病分類，更深入的闡釋發(fā)病原因和更準(zhǔn)確的預(yù)測疾病風(fēng)險或治療效果。

而如此大規(guī)模各異生物標(biāo)本的儲存是所有臨床研究的根本和重中之重。標(biāo)本類型包括全血、血清、血漿、單個核細(xì)胞、疾病組織、糞便等。本中心前期建立了生物樣品采集、處理、貯存和解凍的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，為本項目的生物樣本采集、貯存和管理提供基礎(chǔ)。對臨床生物資源庫的出入庫流程、樣本捐獻(xiàn)者的準(zhǔn)備、臨床樣本的采集與運輸、處理過程進(jìn)行控制，以保證樣本的合理合法使用、樣本質(zhì)量的穩(wěn)定性和有效性，更好地為科學(xué)研究提供準(zhǔn)確、可靠的樣本儲備。本中心基于5年來出生隊列的建立總結(jié)了如下幾條執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，以資借鑒。①設(shè)立臨床生物資源庫倫理委員會和臨床生物資源庫科學(xué)技術(shù)委員會，負(fù)責(zé)入庫項目的審批。②醫(yī)護人員和實驗室人員指導(dǎo)樣本捐獻(xiàn)者如何正確留取樣本。③門診采血人員和病房護理人員負(fù)責(zé)臨床樣本的采集，特殊樣本由臨床醫(yī)生采集。④樣本運送人員負(fù)責(zé)按時按標(biāo)準(zhǔn)運送樣本。⑤臨床生物資源庫工作人員負(fù)責(zé)核收樣本捐獻(xiàn)人員簽署的《知情同意書》并掃描存檔，定期檢查，如發(fā)現(xiàn)缺漏應(yīng)及時與入庫申請者溝通反饋。⑥臨床生物資源庫工作人員負(fù)責(zé)樣本核收和出入庫。

此外，出生缺陷隊列的臨床資料采集也是后續(xù)大數(shù)據(jù)分析重要的參考因素；而臨床數(shù)據(jù)采集主要通過本中心的臨床大數(shù)據(jù)中心集成分散存儲在不同診療系統(tǒng)中的臨床表型、實驗室檢測、影像學(xué)檢查、診療記錄數(shù)據(jù)的遷移集成，清洗轉(zhuǎn)換，元數(shù)據(jù)抽取，實現(xiàn)異構(gòu)整合；利用海量數(shù)據(jù)統(tǒng)一存儲模型，搭建高性能、高可靠、易擴展、易使用的專病主題數(shù)據(jù)倉庫，作為后續(xù)研究的數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)?；诔錾毕輰２≈黝}數(shù)據(jù)倉庫及臨床指南、專家共識、標(biāo)準(zhǔn)等已有的知識型文本，分別通過文本實體識別及語義提取、生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)成功構(gòu)建出生缺陷醫(yī)學(xué)知識網(wǎng)絡(luò)和知識圖譜；并通過進(jìn)一步集成利用深層索引、相關(guān)性挖掘、重要性標(biāo)注、新穎度分析等挖掘工具，實現(xiàn)了出生缺陷精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)知識的抽提、注釋、聚類、關(guān)聯(lián)及分析，構(gòu)建出生缺陷相關(guān)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)知識庫。有助于更深入地詮釋重大出生缺陷發(fā)生的遺傳背景，闡述基因調(diào)控和功能改變在重大出生缺陷發(fā)生發(fā)展中的作用，加速認(rèn)識遺傳、環(huán)境、遺傳－環(huán)境交互作用對重大出生缺陷發(fā)生的關(guān)鍵作用，從而采取有針對性的預(yù)防措施，為出生缺陷防控尤其是出生缺陷一級預(yù)防提供更新的思路。

四、展望

精準(zhǔn)醫(yī)療是以個體化醫(yī)療為基礎(chǔ)，伴隨著基因組測序技術(shù)快速進(jìn)步，以及生物信息與大數(shù)據(jù)科學(xué)的交叉應(yīng)用而發(fā)展起來的。近年來，二代測序技術(shù)由于其快速發(fā)展和成本的降低，正在占據(jù)越來越多的市場份額。通過新一代測序生成不同層面的遺傳數(shù)據(jù)、結(jié)合臨床表型對解析不同出生缺陷個體都具有重要作用，它將大大促進(jìn)我們對出生缺陷疾病譜的遺傳發(fā)病機制的理解。對于每一個患者家庭也是福音，它將能以每一個家庭為單位，鑒定其家族性的致病基因，為優(yōu)生優(yōu)育提供導(dǎo)向。而在人群層面上，對于出生缺陷疾病譜的進(jìn)一步理解，能夠切實指導(dǎo)臨床治療，為特異的靶向藥物提供可能。然而以CHD為例，僅考慮遺傳因素，僅能解釋8%左右的發(fā)病原因；大部分原因是在一定的遺傳背景下結(jié)合環(huán)境因素最終致病。故而發(fā)病機制的復(fù)雜性和不確定性限制了對其風(fēng)險預(yù)測、以及臨床輕重癥預(yù)警及個體精準(zhǔn)化治療的實施。當(dāng)前急需對CHD特征進(jìn)行系統(tǒng)、長期跟蹤，利用母嬰和出生隊列尋找與疾病發(fā)病風(fēng)險以及個體差異相關(guān)的遺傳、表觀遺傳和環(huán)境影響因素，并通過形成預(yù)防和診療指南的形式，提高新生兒和兒童的生活質(zhì)量，節(jié)約社會醫(yī)療成本。

此外，完善的隊列后續(xù)追蹤研究可以為疾病預(yù)后整合個體的遺傳數(shù)據(jù)提供指南。以先天性巨結(jié)腸為例，手術(shù)治療雖能挽救患者的生命，但術(shù)后長期存在明顯的并發(fā)癥。超過50%的短段型先天性巨結(jié)腸患者術(shù)后長期存在便秘、大便失禁和小腸結(jié)腸炎等。長段型的患者長期預(yù)后則更差，大便失禁、反復(fù)發(fā)作的小腸結(jié)腸炎、代謝紊亂、發(fā)育遲緩等發(fā)生率更高，約20%需要行永久性回腸造瘺術(shù)。我們前期已基于遺傳數(shù)據(jù)證實術(shù)后腸炎特異性遺傳變異（未發(fā)表數(shù)據(jù)），基于隊列的長期隨訪，相信能夠?qū)ο忍煨跃藿Y(jié)腸術(shù)后恢復(fù)的臨床指導(dǎo)有部分助益；能為不同臨床表型提出遺傳標(biāo)記物，乃至靶向藥物。總而言之，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)要求既要了解疾病的本質(zhì)，即遺傳變異，又要在結(jié)合不同個體生活環(huán)境、自然屬性的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)個體化及疾病針對性的治療。這一切都依賴于人類基因組不同層面上的研究。在過去的十年間，疾病個體的遺傳背景研究的重要性越來越受到人們重視，相信在未來，對于疾病本身的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)解析一定能為醫(yī)生提供更好的預(yù)防、診斷和治療依據(jù)。

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2017—07—08）

（本文編輯：王愛蓮）

10.3969／j.issn.1671—6353.2017.04.004.

10.3969／j.issn.1671－6353.2017.04.004

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（廣東省廣州市，510623）

夏慧敏，Email：huiminxia＠hotmail.com

本文引用格式：張彥，夏慧敏.精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在兒外科出生缺陷疾病譜中的應(yīng)用研究［J］.臨床小兒外科雜志，2017，16（4）：2017，16（4）：324—327.

Citing this article as：Citing this article as：Zhang Y，Xia HM.Applications of precision medicine in birth defect disease spectrum of pediatric surgery［J］.J Clin Ped Sur，2017，16（4）：324—327.DOI：10.3969／j.issn.1671—6353. 2017.04.004.