宋文菲，楊 爽，苗春輝，梁 鋮，張學(xué)文

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

中蜂雄蜂精液與工蜂中蜂囊狀幼蟲病毒的檢測

宋文菲，楊 爽，苗春輝，梁 鋮，張學(xué)文*

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

為了解同群中蜂雄蜂精液及工蜂中蜂囊狀幼蟲病毒(CSBV)的感染情況，尋找CSBV交尾傳播的間接證據(jù)，利用RT-PCR方法對云南省蒙自市東村的3個中蜂群雄蜂精液及工蜂樣本的CSBV進行檢測。結(jié)果顯示，3個蜂群的工蜂均被檢測出攜帶CSBV，相對應(yīng)的本群雄蜂精液樣本也被檢測出攜帶CSBV，二者呈正相關(guān)關(guān)系，雄蜂精液樣本的平均感染率達到93.33%。結(jié)果表明，雄蜂精液是CSBV的攜帶者，為CSBV的交尾傳播提供了間接證據(jù)。

中蜂囊狀幼蟲病毒；雄蜂；精液；工蜂；RT-PCR

中蜂囊狀幼蟲病(Chinese sacbrood disease,CSBD)簡稱中囊病，是由中蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)感染引起的腸道傳染性疾病，因其癥狀主要見于幼蟲，染病幼蟲不能成功化蛹，蛻皮液集聚在其表皮處，形成囊狀而得名。成年蜜蜂也會感染病毒，雖然不會很快死亡，但會影響其抗病能力，極易感染其他病毒。該病已成為中蜂的主要病害之一，常發(fā)生在春繁季節(jié)，此時蜂群發(fā)展最快，存在大量易感的幼蟲和年輕工蜂。該病毒是一類小核糖核酸病毒[1]，與蜜蜂囊狀幼蟲病毒(Sacbrood bee virus,SBV)為同一病毒屬內(nèi)的2種不同病毒株，是造成蜂群數(shù)量下降的6種主要蜜蜂病毒病之一[2]。蜜蜂病毒的傳播方式是擴大病毒感染范圍并造成蜂群大面積毀滅的重要途徑，包括水平傳播和垂直傳播。水平傳播是指病毒在同一世代的蜜蜂個體中進行傳播，可分為直接與間接2種，直接傳播包括空氣傳播感染、食物傳播感染、交尾傳播感染；間接傳播是指通過起媒介作用的生物宿主進行傳播。垂直傳播則是發(fā)生在親代與子代間的傳播，即可通過親代的卵把病毒傳播給子代。

交尾傳播在嚴格意義上雖歸于水平傳播，但正是交尾傳播的發(fā)生，才導(dǎo)致親代與子代間的垂直傳播，所以交尾傳播是介于兩種傳播途徑之間。2006年，Yue C等[3]在西方蜜蜂雄蜂精液中檢測到RNA病毒急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus, ABPV)及與CSBV同屬于傳染性軟腐病病毒屬Iflavirus的蜜蜂殘翅病毒(Deformed wing virus, DWV)，并測得病毒序列，證實了蜜蜂病毒交尾傳播方式的存在。de Miranda J R等[4]利用蜜蜂人工授精技術(shù)發(fā)現(xiàn)DWV的交尾傳播和垂直傳播方式是相關(guān)聯(lián)的，Yaez O等[5]發(fā)現(xiàn)高DWV滴度并不會影響雄蜂到達雄蜂聚集區(qū)參加與蜂王的交配，證實在自然交尾中通過雄蜂進行的交尾傳播方式。而關(guān)于中蜂雄蜂是否會攜帶CSBV及驗證CSBV交尾傳播的研究還未見報道，因此，基于西方蜜蜂病毒病方面的研究，本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測同群中蜂雄蜂精液及工蜂的CSBV帶毒情況，以求為CSBV的交尾傳播提供間接證據(jù)，為進一步系統(tǒng)地研究該病的交尾及垂直傳播提供前期基礎(chǔ)，進而為抗病毒中蜂優(yōu)良品種的培育研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 時間與地點 樣品采集時間為CSBV高發(fā)的秋季，時間為2015年9月21日。采集地點為云南省紅河州蒙自市東村，平均海拔1 280 m。

1.1.2 樣品采集 蜂種為滇南中蜂，每群隨機取活體樣品成年工蜂5只，同時每采取5只雄蜂精液為1個樣品，每群采取5個樣品，共3群(由于本所內(nèi)中蜂場當時沒有雄蜂，本次樣本是在自家院子內(nèi)養(yǎng)的蜂群，且只有3群，也符合統(tǒng)計樣本標準，故在有限的時間內(nèi)只能選擇這3群樣本作為本次試驗樣本)，置-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 參照文獻[6]方法，并加以改進。具體步驟如下：每群取5只工蜂樣品，取1只置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入1 mL Trizol，用玻璃研棒充分勻漿，靜置5 min。加入200 μL氯仿，充分震蕩，靜置2 min。4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液400 μL～600 μL，加氯仿200 μL，混勻靜置5 min；4℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液200 μL～300 μL，加入等量的異丙醇，混勻，靜置10 min；4℃、12 000 r/min離心10 min；沉淀以750 mL/L乙醇洗滌；4℃、12 000 r/min離心5 min；倒去乙醇，真空抽干，用40 μL DEPC處理水溶解，置-80℃保存?zhèn)溆?。精液樣品的總RNA提取也同上，只是精液樣品在研磨時，用力較輕。

1.2.2 RT-PCR擴增 引用文獻中SBV片段SB1-2引物SBV-F(5′-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3′)，SBV-R (5′-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3′)[7]。RT-PCR 反應(yīng)體系為：20 μL 體系中含有RNase Free ddH2O 8.7 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，10×One step RNA PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture各(10 mmol/L) 2 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.3 μL，AMV Reverse Transcriptase XL(5 U/μL) 0.3 μL，AMV-OptimizedTaq

(5 U/μL) 0.3 μL，上、下游引物各0.8 μL，總RNA 0.8 μL。反應(yīng)條件：50℃ 30 min；94℃ 2 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；4℃結(jié)束反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5 μL用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 同群雄蜂精液與工蜂的RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果見圖1、圖2和圖3。所選引物預(yù)期的擴增片段長度為487 bp。圖1為1、2號群工蜂感染CSBV情況，其中1～5樣品為1號群工蜂，6～10樣品為2號群工蜂，除樣品5未檢測出CSBV外，其余9個樣品均有不同程度的CSBV感染。圖2為1、2號群雄蜂精液感染CSBV情況，其中1～5樣品為1號群雄蜂精液，6～10樣品為2號群雄蜂精液，電泳結(jié)果顯示所有 10個樣品均有不同程度的CSBV感染。圖3為3號群雄蜂精液和工蜂感染CSBV情況，其中1～5樣品為3號群雄蜂精液，6～10樣品為3號群工蜂，除樣品3未檢測出CSBV外，其余9個樣品均有不同程度的CSBV感染。結(jié)果表明，在3群工蜂被檢測出CSBV感染時，相對應(yīng)的該群雄蜂精液也被檢測出CSBV感染，二者呈正相關(guān)性。

M.DNA標準DL 1 000; 1～4、6～10.感染CSBV的樣品(487 bp)；5.未感染CSBV的樣品

M.DNA標準DL 1 000; 1～10.感染CSBV的樣品(487 bp)

M.DNA標準DL 1 000; 1～2、4～10.感染CSBV的樣品(487 bp)；3.未感染CSBV的樣品

2.2 CSBV感染率

通過檢測，發(fā)現(xiàn)3群中蜂雄蜂精液和工蜂樣品均不同程度地感染了CSBV，每群的平均感染率在90%以上，甚至可以達到100%(表1)，總的平均感染率為93.33%。

表1 3群中蜂蜂群雄蜂精液、工蜂感染CSBV情況

3 討論

中蜂是我國的本土蜂種，蜂種多樣性極其豐富，中國畜禽資源遺傳志(蜜蜂志)中共收錄9種地理型中蜂蜂種，不僅提供著高價值的蜂產(chǎn)品，其授粉行為還創(chuàng)造了巨大的農(nóng)產(chǎn)品增收效益和無法估量的生態(tài)效益。中囊病不但嚴重威脅著中蜂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而且也嚴重影響蟲媒植物的生長，破壞了生態(tài)平衡。該病在我國發(fā)病最重，自20世紀70年代初暴發(fā)以來，在近10年里，造成近百萬群中蜂損失，目前仍然是威脅我國中蜂飼養(yǎng)及種群發(fā)展的重要病害[7]。由于國內(nèi)蜜蜂病毒病的流行與分子傳播機制尚無明確的定論，生產(chǎn)實踐中還未找到行之有效的防治方法。目前，對CSBD的防控措施的研究報道多局限在發(fā)病后，采取藥物、加強飼養(yǎng)管理、換王斷子等，而從病毒的傳播途徑角度尋找解決方法的研究卻鮮有報道。雄蜂在蜜蜂群體中只是起到交配的作用，它不能自己覓食，只能取食工蜂貯藏于蜂巢中的食物，一旦交配季節(jié)度過，在缺乏蜜粉時它就會被工蜂驅(qū)趕，并被活活餓死。本研究首次在中蜂雄蜂精液中檢測到CSBV,研究結(jié)果表明工蜂可通過食物接觸等方式將病毒傳播給雄蜂，進而雄蜂可通過與處女蜂王的交尾行為將病毒傳播給蜂王。

自從2006年北美及歐洲暴發(fā)“蜂群崩潰失調(diào)癥”(Colony collapse disorder，CCD)，蜜蜂病毒病更加引起人們的重視[8]。因此，病毒的傳播方式也成為了研究者研究疾病防控的一個重要方面。研究發(fā)現(xiàn)，西蜂蜂群內(nèi)的蜂螨是重要的蜜蜂病毒傳播媒介，并影響著病毒的地理流行病學(xué)[9-10]。2006年，Chen Y P等[11]首次對蜜蜂群內(nèi)包括SBV在內(nèi)的6種病毒垂直傳播方式進行了研究，證實了蜜蜂病毒病可通過蜂王傳播給其子代。傳播方式的研究，看似為防治蜜蜂病毒病提供了新的解決措施，但應(yīng)從哪一方面進行疾病防控還未有定論。我國是蜜蜂疾病流行與暴發(fā)最為嚴重地區(qū)之一，每年因疾病流行損失大量飼養(yǎng)蜂群，疾病的廣泛傳播成為我國蜜蜂生物多樣性快速下降的一個主要因素[12]。蜂王與多個雄蜂的自由交配行為對于蜜蜂疾病的傳播是一種固有風險[13]，因為雄蜂可以訪問距其蜂群8 km的聚集地，在雄蜂聚集區(qū)有大量不同蜂場和蜂群的雄蜂，而要控制蜜蜂交配，就需要有半徑20 km以上的隔離區(qū)，實際養(yǎng)殖中卻很難滿足這一要求，一旦雄蜂染病，極易造成疾病大范圍傳播。因此，雄蜂是否會攜帶病毒對病毒病防控是至關(guān)重要的，本文研究結(jié)果證實了看似健康的雄蜂是CSBV的攜帶者，為CSBV交尾傳播方式提供了間接證據(jù)。但要搞清CSBV交尾傳播方式及與CSBV大范圍傳播之間的相互關(guān)系，還需要通過蜜蜂人工授精及其他分子生物學(xué)手段進行系統(tǒng)的研究。

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Detection of Chinese Sacbrood Virus in Drone Semen and Worker Bees ofApiscerana

SONG Wen-fei,YANG Shuang,MIAO Chun-hui,LIANG Cheng,ZHANG Xue-wen

(InstituteofSericultrueandApiculture,YunnanAcademyofAgricultrualSciences,Mengzi，Yunnan，661101，China)

In order to understand the infection of Chinese sacbrood virus(CSBV )in drones semen and worker bees ofApisceranaand seek indirect evidence for venereal transmission of CSBV in the same colony, CSBV in drone semen and worker bees were detected by RT-PCR in Mengzi of Yunnan.The results showed that CSBV were detected both in drone semen and worker bees, and there was a positive correlation between the infection of CSBV in drone semen and worker bees, the average infection rate of the drone semen was 93.33%. The results indicated that drone semen was CSBV carrier, which provided indirect evidence for venereal transmission of CSBV.

Chinese sacbrood virus; drone; semen; worker bee; RT-PCR

2016-07-01

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(蜜蜂)“紅河綜合試驗站”(CARS-45-SYZ 17 )；云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)性超前預(yù)研項目( 2014CZJC014 )

宋文菲(1983-)，女，吉林蛟河人，助理研究員，碩士，主要從事蜜蜂病害防治及良種選育研究。*通訊作者

S855.3

A

1007-5038(2017)02-0064-04