朱永剛，王 磊，崔東安，王旭榮，張景艷，張 凱，張 康，王學(xué)智，楊志強(qiáng)，李建喜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050)

宮衣凈酊中鹽酸水蘇堿HPLC-ELSD測(cè)定方法的建立

朱永剛，王 磊，崔東安，王旭榮，張景艷，張 凱，張 康，王學(xué)智，楊志強(qiáng)，李建喜*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050)

為了建立宮衣凈酊中鹽酸水蘇堿的HPLC測(cè)定方法，采用的色譜條件為色譜柱為賽分Sepax polar-propylamide(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-2 mL/L的冰醋酸(65∶35)，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為30℃。檢測(cè)器參數(shù)為飄逸管溫度為105℃，霧化室的溫度為60℃，載氣體積流量為1.0 mL/min。結(jié)果表明，在此色譜條件下，鹽酸水蘇堿的線性范圍0.155 mg/mL～248.00 mg/mL(R2=0.999 9，n=6)，平均回收率為95.46% (RSD=1.08%)。說明本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以作為宮衣凈酊的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；宮衣凈酊；鹽酸水蘇堿；含量測(cè)定

宮衣凈酊是由益母草、紅花、葛根等中藥制成的酊劑，其臨床功效主要有活血化淤、促進(jìn)胎衣排出、凈化子宮、加快產(chǎn)后子宮復(fù)舊、促進(jìn)產(chǎn)后繁殖性能的恢復(fù)。前期試驗(yàn)證實(shí)，宮衣凈酊具有治療奶牛胎衣不下的效果，預(yù)防奶牛胎衣不下有效率達(dá)95%，治愈率達(dá)85.7%[1-2]。益母草為唇形科植物益母草的干燥地上部分，具有活血通經(jīng)、利尿消腫等功效。鹽酸水蘇堿是益母草的主要成分之一，由于其性質(zhì)穩(wěn)定。因此，選用鹽酸水蘇堿作為宮衣凈酊有效成分的含量控制指標(biāo)之一。《中國(guó)獸藥典》(2010年版)中錄入了益母草中鹽酸水蘇堿的HPLC含量測(cè)定方法[3]，由于宮衣凈酊是中藥復(fù)方酊劑，成分較多，故該方法不適宜于宮衣凈酊中鹽酸水蘇堿的含量測(cè)定。鹽酸水蘇堿的檢測(cè)方法有雷氏鹽剩余比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法(使用紫外檢測(cè)器)等[4-8]。雷氏鹽剩余比色法的缺點(diǎn)是操作繁瑣，誤差較大, 不適用于成分復(fù)雜的中成藥;而薄層掃描法的缺點(diǎn)是重現(xiàn)性和靈敏度較差;鹽酸水蘇堿屬于季銨鹽型生物堿, 僅在末端有紫外吸收, 因而采用紫外-高效液相色譜法其它成分對(duì)其測(cè)定有很大的干擾[9]。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light-scattering detector ,ELSD)是一種新型的通用型質(zhì)量檢測(cè)器，能檢測(cè)任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的化合物，特別是無特征紫外吸收或紫外末端吸收的物質(zhì)，與紫外檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器和核磁共振檢測(cè)器等用于檢測(cè)自然界中的所有物質(zhì)，特別是在中藥分析中有很廣泛的應(yīng)用[4,10]。為更好的控制該酊劑的質(zhì)量，確保臨床療效，本文采用HPLC-ELSD方法對(duì)宮衣凈酊中的鹽酸水蘇堿進(jìn)行含量測(cè)定，以期為宮衣凈酊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀，美國(guó)Dionex公司產(chǎn)品；賽分Sepax polar-propylamide色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國(guó)賽分科技公司產(chǎn)品；超聲波清洗器KQ-250型，昆山市超聲儀有限公司產(chǎn)品；超純水制備儀，力康公司產(chǎn)品；ME235S微量分析天平，Sartorius公司產(chǎn)品；Agilent bond elut scx 固相萃取小柱,美國(guó)安捷倫科技公司產(chǎn)品。

1.1.2 藥品 鹽酸水蘇堿對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)為110752-201313；宮衣凈酊樣品，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心研制，主要由益母草、紅花、葛根等藥組成，每瓶200 mL；乙腈，F(xiàn)isher Scientific公司產(chǎn)品，色譜純；純化水自制；乙醇為分析純；冰醋酸，Macklin公司產(chǎn)品，色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為賽分Sepax polar-propylamide(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；流動(dòng)相：流動(dòng)相為乙腈-2 mL/L的冰醋酸(65∶35)，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。檢測(cè)器參數(shù)：飄逸管溫度為105 ℃，霧化室的溫度為60 ℃，載氣體積流量為1.0 mL/min。在上述色譜條件下，鹽酸水蘇堿的典型保留時(shí)間為18.9 min，理論塔板數(shù)以鹽酸水蘇堿峰計(jì)算不低于6 000。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸水蘇堿對(duì)照品5 mg，用適量700 mL/L乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加700 mL/L乙醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取宮衣凈酊樣品溶液2 mL，用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1～2，取Agilent bond elut scx固相萃取小柱，依次用甲醇、400 mL/L乙醇各2 mL活化，將酸化后的樣品過柱；依次用超純水6 mL淋洗；甲醇/氨水(30/70)15 mL洗脫。洗脫液蒸干，加700 mL/L乙醇溶解，轉(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中不含益母草藥材的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

1.2.5 方法專屬性試驗(yàn) 按照1.2.1所述色譜條件，分別取宮衣凈酊供試品溶液、陰性溶液以及鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC分析。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液，分別制備成0.155、0.31、0.62、1.24、2.48 mg/mL的濃度梯度對(duì)照品溶液。按照1.2.1所述色譜條件，取上述鹽酸水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC分析，以峰面積y相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度x進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一宮衣凈酊供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照1.2.1所述色譜條件，測(cè)定其峰面積。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一宮衣凈酊供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按照1.2.1所述色譜條件，測(cè)定鹽酸水蘇堿含量。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批宮衣凈酊供試品溶液，按照供試品制備方法平行制備6份，按照1.2.1所述色譜條件測(cè)定鹽酸水蘇堿含量。

1.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取同一批次已知含量的宮衣凈酊樣品溶液6份，每份2 mL，分別加入與樣品所含鹽酸水蘇堿量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，搖勻。按制備供試品溶液的方法制備，并測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。

回收率=(實(shí)測(cè)值-供試品中鹽酸水蘇堿含量)/對(duì)照品鹽酸水蘇堿加入量×100%。

1.2.11 樣品含量的計(jì)算方法 按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中鹽酸水蘇堿含量的公式：X=C/V

X為樣品中鹽酸水蘇堿的含量(mg)；C為樣品中色譜峰的面積積分值對(duì)應(yīng)的鹽酸水蘇堿的濃度(mg/mL);V為樣品的體積(mL)。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸水蘇堿含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

鹽酸水蘇堿線性回歸方程：y=0.237 2x-22.114 (R2=0.999 9，n=6)，結(jié)果如圖1所示。鹽酸水蘇堿在18.25 μg～584.00 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 鹽酸水蘇堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度試驗(yàn)

測(cè)定6份同一批次的宮衣凈酊樣品中鹽酸水蘇堿含量，其RSD為0.88%(n=6)，結(jié)果表明精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

宮衣凈酊樣品分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，鹽酸水蘇堿含量的RSD為0.87%(n=6)，表明宮衣凈酊供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

選取6個(gè)不同批次的宮衣凈酊樣品進(jìn)行測(cè)定，宮衣凈酊中鹽酸水蘇堿含量的RSD為0.89%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

宮衣凈酊中鹽酸水蘇堿的平均回收率為95.46%，RSD為1.08%(表1)，表明本試驗(yàn)具有良好的回收率。

2.6 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

結(jié)果顯示在該色譜條件下，其他成分不干擾鹽酸水蘇堿的測(cè)定，可與其他成分達(dá)到基線分離(圖2)。

表1 鹽酸水蘇堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

A.宮衣凈酊陰性樣品; B.鹽酸水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品; C.宮衣凈酊供試品A.Negative sample of Gong-Yi-Jing tincture; B.Standard sample of stachydrine hydrochloride; C.Sample of Gong-Yi-Jing tincture

3 討論

3.1 檢測(cè)器的選擇

鹽酸水蘇堿屬于季銨堿，結(jié)構(gòu)中無共軛體系。因此，對(duì)紫外吸收非常弱，通過對(duì)鹽酸水蘇堿進(jìn)行紫外光譜掃描，鹽酸水蘇堿僅在紫外末端有吸收，其最大吸收波長(zhǎng)為192.4 nm[9]。紫外檢測(cè)器檢驗(yàn)具有末端吸收的物質(zhì)要求被檢測(cè)物質(zhì)純度高、干擾少。但由于宮衣凈酊是中藥復(fù)方酊劑，成分復(fù)雜，若采用紫外-可見光檢測(cè)器，干擾較大，且流動(dòng)相的溶劑末端吸收也會(huì)帶來較大的干擾。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種新型的通用型質(zhì)量檢測(cè)器，與紫外檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器和核磁共振檢測(cè)器等用于檢測(cè)自然界中的所有物質(zhì)，特別是在中藥分析中有很廣泛的應(yīng)用。由于中藥的化學(xué)成分較為復(fù)雜，部分成分不存在紫外吸收或僅在紫外末端有吸收，加上色譜的分離困難以及流動(dòng)相的干擾，使用傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行定量十分困難，而ELSD彌補(bǔ)了紫外檢測(cè)器這方面的不足，被廣泛的應(yīng)用于生物堿類成分、皂苷類成分、糖類成分的分析，并取得了不錯(cuò)的效果[4,10-11]。故本試驗(yàn)采用通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[4]，通過對(duì)霧化器溫度、漂移管溫度、氣體流速等各種檢測(cè)器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳峰形和最大信噪比。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法適合用于宮衣凈酊中鹽酸水蘇堿的定量檢測(cè)。

3.2 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

由于鹽酸水蘇堿屬于強(qiáng)極性的酸堿兩性小分子化合物，很難在C18柱中進(jìn)行保留，不適用于宮衣凈酊這種中藥復(fù)方酊劑的含量測(cè)定。故本試驗(yàn)改用益母草專用柱進(jìn)行鹽酸水蘇堿的分析。采用HPLC法測(cè)定中藥復(fù)方制劑中的鹽酸水蘇堿，流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇有不同組成，為了得到較好的色譜圖和適宜的保留時(shí)間，本試驗(yàn)比較了不同流動(dòng)相分離的效果，如乙腈∶水(90∶10)(85∶15)[12-13]，均未能與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，而當(dāng)選擇乙腈-2 mL/L冰醋酸(35∶65)作為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，鹽酸水蘇堿在18 min～21 min之間出峰，并與雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，分離效果好，保留時(shí)間適中，故選其作為流動(dòng)相。

3.3 提取方法的選擇

由于宮衣凈酊是由多種中藥復(fù)方構(gòu)成，樣品溶液中所含雜質(zhì)很多，如果不通過凈化處理而進(jìn)行直接分析液相色譜分析，會(huì)造成雜質(zhì)峰過多，且會(huì)嚴(yán)重影響色譜柱的使用壽命。因此《中國(guó)獸藥典》中700 mL/L乙醇直接提取鹽酸水蘇堿的供試品溶液制備方法并不適用于宮衣凈酊樣品中鹽酸水蘇堿的提取。本試驗(yàn)對(duì)以下3種方法進(jìn)行比較:①中性氧化鋁法；②雷氏銨鹽法；③Agilent bond elut scx固相萃取法[14-15]。結(jié)果表明,方法③操作簡(jiǎn)單，提取的鹽酸水蘇堿含量高，并且能夠達(dá)到基線分離。有文獻(xiàn)報(bào)道用甲醇提取鹽酸水蘇堿效果最好[9]，本試驗(yàn)對(duì)供試品溶液提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，甲醇提取的鹽酸水蘇堿未能達(dá)到基線分離，而700 mL/L乙醇能夠達(dá)到基線分離，故最終采用700 mL/L乙醇為供試品提取溶劑。

綜上所述，本試驗(yàn)所采用的HPLC-ELSD法在測(cè)定宮衣凈酊中鹽酸水酸堿的含量，專屬性強(qiáng)、相關(guān)性好、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，是測(cè)定宮衣凈酊成分含量的有效方法，為宮衣凈酊中鹽酸水蘇堿含量測(cè)定的應(yīng)用研究提供了可靠依據(jù)。

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Establishement of HPLC-ELSD Assay for Determination of Stachydrine Hydrochloride Content in Gong-Yi-Jing Tincture

ZHU Yong-gang，WANG Lei，CUI Dong-an，WANG Xu-rong，ZHANG Jing-yan，ZHANG Kai,ZHANG Kang,WANG Xue-zhi,YANG Zhi-qiang，LI Jian-xi

(LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050，China)

In order to establish an HPLC method for the determination of stachydrine hydrochloride in Gong-Yi-Jing tincture,Sepax polar-propylamide column(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used.The mobile phase of acetonitrile to 2 mL/L glacial acetic acid (35∶65)and flow rate of 0.5 mL/min were set,the injection volume is 10 μL.The column temperature is 30℃.The detector parameters:the evaporation temperature is 105 ℃,the nebulizer temperature is 60 ℃,the flow rate is 1.0 mL/min.The results showed that,in these chromatographic conditions,the liner range of stachydrine hydrochloride was 0.155 mg/mL-248.00 mg/mL (r=0.999 9,n=6),the average recovery was 95.46%(R=1.08%,n=6).The HPLC method is repeatable,sensitive,and accurate,and can be used for quality control of Gong-Yi-Jing tincture.

HPLC; ELSD; Gong-Yi-Jing tincture; stachydrine hydrochloride; content determination

2016-07-03

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201303040)

朱永剛(1991-)，男，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事奶牛中獸藥研發(fā)。*通訊作者

S859.799.1

A

1007-5038(2017)02-0060-04