解穎穎，胡學(xué)權(quán)，崔京春，李廣興，葛 銘，張瑞莉*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600)

脂多糖誘導(dǎo)哺乳期SD大鼠乳腺炎模型的建立

解穎穎1，胡學(xué)權(quán)1，崔京春2，李廣興1，葛 銘1，張瑞莉1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600)

本試驗旨在建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)哺乳期SD大鼠乳腺炎病理模型，為后續(xù)治療乳腺炎的深入研究奠定基礎(chǔ)。SD大鼠30只，于產(chǎn)后72 h隨機(jī)分為對照組(5只)和試驗組(25只)，試驗組隨機(jī)分為5組，各試驗組大鼠經(jīng)第4對乳頭灌注LPS，劑量分別為10 、20、30、40、50 μg/側(cè)，對照組灌注等量PBS。灌注后24 h觀察記錄各大鼠臨床癥狀、乳腺組織病理學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各試驗組大鼠第4對乳腺均可觀察到不同程度的炎癥反應(yīng)，且與LPS劑量呈正比例關(guān)系。結(jié)果表明，成功建立了LPS誘導(dǎo)哺乳期SD大鼠乳腺炎模型。

SD大鼠；脂多糖；乳腺炎；病理模型

在世界各地，乳腺炎是一種影響乳用家畜和哺乳期婦女健康的重要疾病[1]。乳腺炎能導(dǎo)致哺乳期婦女、奶牛、綿羊、山羊、母豬、蜂王和母馬乳腺的腫脹、疼痛、發(fā)紅及發(fā)熱[2]。該病不僅危害人類健康且為全球乳業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失。另外，乳腺炎對動物的繁殖性能也有嚴(yán)重影響，與健康的奶牛相比，乳腺炎患畜的受孕率較低[3]。

乳腺炎的致病因素復(fù)雜多樣，通常由多種病原微生物感染引起。環(huán)境性致病菌以大腸埃希菌為代表，該菌引起的急性臨床型乳腺炎約占本類型乳腺炎的40%～50%，而其中近25%的病例最終死亡或遭到淘汰[4]。大腸埃希菌具有很多毒力因子，包括內(nèi)毒素(lipopolysaccharides，LPS)、莢膜、黏附素和外毒素等，其中LPS是大腸埃希菌主要的致病毒力因子，是被感染宿主識別的中心，其致病機(jī)理也被廣泛研究，能夠引起動物機(jī)體急性炎癥過程。研究發(fā)現(xiàn)，LPS作用于乳腺誘發(fā)的乳腺炎與大腸埃希菌感染誘發(fā)的乳腺炎相似[5]。因此，本研究擬以哺乳期SD大鼠為實(shí)驗動物，用5種不同劑量的LPS誘導(dǎo)其乳腺炎癥，研究致病后24 h的乳腺眼觀病理及組織學(xué)變化，以期建立適合乳腺炎研究的動物模型，為該疾病的發(fā)生機(jī)制、治療方法和預(yù)防措施的深入研究提供科學(xué)的基礎(chǔ)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 健康成年SD大鼠，雌性30只，體重250 g～280 g，均未孕；雄性15只，體重300 g～350 g。飼喂市售飼料，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌鼠與雄鼠按2∶1比例同籠飼養(yǎng)，使之交配受孕。

1.1.2 主要試劑與儀器 脂多糖(LPS)，Sigma公司產(chǎn)品，由O55：B5血清型大腸埃希菌分離提純，滅菌PBS配成1 mg/mL，置-20℃避光保存?zhèn)溆茫徽脽晒怙@微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗動物分組 30只健康SD孕鼠隨機(jī)分為對照組(5只)和試驗組(25只)，試驗組隨機(jī)分為5組(T1組、T2組、T3組、T4組、T5組)。正常分娩后72 h，用犬眠寶(0.20 mL/kg～0.25 mL/kg)肌肉注射將母鼠麻醉、保定。用750 mL/L乙醇溶液對第4對乳腺區(qū)域(腹部乳區(qū))進(jìn)行消毒，然后用小鑷子輕輕夾起乳頭，用微量注射器輕輕刺破皮膚沿乳頭管插入，分別灌注LPS 10 μg/側(cè)(T1組)、20 μg/側(cè)(T2組)、30 μg/側(cè)(T3組)、40 μg/側(cè)(T4組)和 50 μg/側(cè)(T5組)，對照組灌注等量的滅菌 PBS，每只鼠兩側(cè)乳頭均灌注相同劑量，然后輕柔地按摩乳腺使灌注的溶液均勻分布。乳房灌注前的24 h將仔鼠與母鼠分離。

1.2.2 樣品采集及處理 乳頭灌注LPS后24 h觀察并記錄各組母鼠臨床癥狀和乳腺局部變化。肌肉注射犬眠寶將母鼠麻醉，然后斷頸處死。將其放于750 mL/L酒精中消毒后小心剪開腹部皮膚，暴露第4對乳腺，快速觀察乳腺病理變化并將其剝離，于40 mL/L多聚甲醛中固定24 h。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察 取固定好的乳腺組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片及HE染色后，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察分析并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和眼觀病理變化

灌注LPS 24 h后，與對照組相比，T1組和T2組母鼠采食飲水基本正常，但是活動量減少；T3組和T4組母鼠采食量和飲水量均減少、精神沉郁；T5組母鼠有3只死亡，2只未死亡的母鼠食欲明顯下降、精神萎靡、弓背蜷縮。剖開腹部皮膚，眼觀乳腺組織，對照組呈淡粉色，有光澤(圖1A)；T1組和T2組乳腺組織顏色較正常組大鼠暗、體積輕微增大、可見血管數(shù)量稍增多(圖1B、圖1C)；T3組乳腺呈潮紅色、可見血管數(shù)量明顯增多(圖1D)；T4組乳腺呈灰白色、明顯腫脹、可見血管數(shù)量多(圖1E)，且可見出血點(diǎn)和出血斑(圖1E)；T5組乳腺呈暗紫色、腫脹(圖1F)。

A.對照組乳腺組織；B～F.試驗組乳腺組織(B.灌注10 μg/側(cè)LPS后24 h的乳腺組織；C.灌注20 μg/側(cè)LPS后24 h的乳腺組織；D.灌注30 μg/側(cè)LPS后24 h的乳腺組織；E.灌注40 μg/側(cè)LPS后24 h的乳腺組織；F.灌注50 μg/側(cè)LPS后24 h的乳腺組織)

A.Control group; B-F.Treatment groups (B.Mammary gland infused with 10 μg/side; C.Mammary gland infused with 20 μg/side; D.Mammary gland infused with 30 μg/side; E.Mammary gland infused with 40 μg/side; F.Mammary gland infused with 50 μg/side)

圖1 灌注LPS后SD大鼠乳腺組織眼觀病理變化
Fig.1 Grossly histopathological lesions in SD rat mammary gland infused with different amount LPS

2.2 病理組織學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡下觀察各組SD大鼠乳腺組織，分析組織炎癥程度。

對照組：泌乳期SD大鼠乳腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，小葉間間隙小。腺泡結(jié)構(gòu)完整，腺泡高度擴(kuò)張，各個腺泡間無明顯間隙，腺泡腔內(nèi)乳汁充盈，染色呈粉紫色；乳腺上皮細(xì)胞成扁平狀，胞核呈深藍(lán)色(圖2A)。

T1組和T2組：乳腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，小葉間間隙較對照組增寬，結(jié)締組織稍有增多，T2組偶見粉色著染的滲出液。腺泡結(jié)構(gòu)完整，相對增寬的各個腺泡間零星散在紅細(xì)胞，腺泡腔內(nèi)乳汁充盈但比較稀薄，乳汁呈粉紫色。腺泡腔內(nèi)還散在有少量多形核中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，少量乳腺上皮細(xì)胞輕微腫脹，核稍大而圓，也有個別乳腺上皮細(xì)胞壞死、脫落(圖2B和圖2C)。

T3組：乳腺小葉結(jié)構(gòu)比較清晰，小葉間間隙明顯增寬，結(jié)締組織增多，小葉間血管內(nèi)可見較多紅細(xì)胞。腺泡結(jié)構(gòu)相對完整，腺泡間散在有少量紅細(xì)胞、多形核中性粒細(xì)胞，部分乳腺上皮細(xì)胞體積增大，有的壞死脫落。腺泡腔內(nèi)乳汁減少、淡染呈絮狀，且腔內(nèi)散在少量壞死脫落的上皮細(xì)胞(圖2D)。

T4組：乳腺小葉結(jié)構(gòu)仍可辨認(rèn)，但小葉間間隙相對T3組有減小趨勢，小葉間及血管內(nèi)可見多量紅細(xì)胞，有時可見粉色著染的滲出物。乳腺腺泡結(jié)構(gòu)不清晰，上皮細(xì)胞腫脹、排列疏松，腺泡腔內(nèi)乳汁減少呈絮狀，其間散在有脫落的上皮細(xì)胞。各個腺泡之間散在較多紅細(xì)胞，小葉間、腺泡腔內(nèi)可見一定數(shù)量的多形核中性粒細(xì)胞浸潤(圖2E)。

T5組：乳腺小葉結(jié)構(gòu)被破壞，基本無法辨認(rèn)，乳腺腺泡結(jié)構(gòu)不完整甚至消失，有的小葉周圍有結(jié)蹄組織增生，相對T3、T4組紅細(xì)胞數(shù)量有所減少。乳腺上皮細(xì)胞腫脹明顯，胞核大而圓，較多壞死脫落。脫落的上皮細(xì)胞間還可見散在較多的多形核中性粒細(xì)胞，腺泡間散在紅細(xì)胞(圖2F)。

A、a.對照組乳腺組織；B～F和b～f.試驗組乳腺組織(B、b.灌注10 μg/側(cè)LPS的乳腺組織；C、c.灌注20 μg/側(cè)LPS的乳腺組織；D、d.灌注30 μg/側(cè)LPS的乳腺組織；E、e.灌注40 μg/側(cè)LPS后的乳腺組織；F、f.灌注50 μg/側(cè)LPS的乳腺組織)

A and a.Control group; B-F and b-f .Treatment groups (B，b.Mammary gland infused with 10 μg/side; C，c.Mammary gland infused with 20 μg/side; D，d.Mammary gland infused with 30 μg/side; E，e.Mammary gland infused with 40 μg/side; F，f.Mammary gland infused with 50 μg/side)

圖2 灌注LPS后SD大鼠乳腺組織病理學(xué)變化
Fig.2 Microscopically histopathological lesions in SD rat mammary gland infused with different amount LPS

3 討論

乳腺炎掣肘我國畜牧業(yè)，甚至危害人類健康。深入研究乳腺炎的發(fā)病機(jī)制、治療方法和預(yù)防措施，需要規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的動物模型。之前，已有報道用奶牛、奶山羊和兔等動物制作乳腺炎病理模型[6]，從1970年首例小鼠乳腺炎模型出現(xiàn)開始[7]，由于鼠的價格低廉且乳腺結(jié)構(gòu)與乳用家畜相似，已成為該模型制作的首選動物。國內(nèi)外建立乳腺炎模型較多采用小鼠作為試驗動物，小鼠成本低、重復(fù)性好。但是小鼠體積小、乳腺組織供應(yīng)少、乳房灌注操作困難。本研究采用SD大鼠作為乳腺炎病理模型研究的試驗動物，大鼠體積大，相對小鼠操作簡便，更易進(jìn)行乳房灌注，而且便于確定穴位的位置，適合針刺研究。另外，在大鼠中，Wistar大鼠進(jìn)行乳腺炎模型建立的相對較多，而本研究則選擇了SD大鼠進(jìn)行模型的建立。因SD大鼠生長發(fā)育較Wistar大鼠更快，繁育性能好，對性激素敏感性強(qiáng)[8]。研究表明激素對乳腺炎的發(fā)生及治療有一定的作用[9]，為了建立更適合激素、激素樣作用的植物提取物或針刺治療乳腺炎研究的模型，本文選擇了SD大鼠作為實(shí)驗動物。

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等常作為乳腺炎模型制作的誘導(dǎo)細(xì)菌。張大松等[10]用高、低濃度金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌聯(lián)合誘導(dǎo)SD大鼠發(fā)生乳腺炎。大腸埃希菌是環(huán)境致病菌，通常引起乳用家畜的急性臨床型乳腺炎，張書起等[11]通過在健康SD大鼠一側(cè)乳區(qū)接種200 μL(107CFU/mL)大腸埃希菌懸液復(fù)制出乳房炎病理模型。但是，大腸埃希菌菌體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與其相比，LPS能夠表現(xiàn)出更好的一致性和重復(fù)性。LPS是大腸埃希菌細(xì)胞壁外膜中的主要成分，在體內(nèi)可以通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，進(jìn)而引起機(jī)體一系列的反應(yīng)[12]，是引起乳腺炎的主要致病因子。LPS與大腸埃希菌全菌體引起的最初機(jī)體免疫反應(yīng)相似[13]，同樣能引起紅、腫、熱、痛、全身機(jī)能障礙及產(chǎn)奶量下降等臨床特征。為了復(fù)制出重復(fù)性更好、管理化更標(biāo)準(zhǔn)、操作更簡易的急性臨床型乳腺炎動物模型，目前傾向于采用LPS制作乳腺炎動物模型。然而不同劑量的LPS引起乳腺炎癥的程度有何不同，詳細(xì)報道較少。本研究選用哺乳期SD大鼠，根據(jù)鐘凱等[14]報道，經(jīng)乳頭灌注不同劑量的LPS(分別為10 、20、30、40、50 μg/側(cè))，制作相同時間點(diǎn)不同程度的乳腺炎病理模型。臨床癥狀和眼觀病理變化顯示，與對照組相比，灌注LPS后24 h，各試驗組大鼠乳腺均有不同程度的炎癥反應(yīng)和損傷，50 μg/側(cè)劑量組出現(xiàn)母鼠死亡現(xiàn)象；與之相對應(yīng)的病理組織學(xué)顯示，試驗組SD大鼠乳腺組織有不同程度的充血、出血和PMN浸潤，乳腺小葉和腺泡結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞，乳汁產(chǎn)量及性狀也有所改變，這些變化與LPS呈劑量依賴關(guān)系。與齊宏亮等[15]報道的臨床型奶牛乳腺炎組織病理學(xué)類似，LPS誘導(dǎo)的SD大鼠乳腺炎也呈現(xiàn)出不同類型的乳腺炎，如漿液性、出血性、卡他性乳腺炎。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，乳頭灌注50 μg/側(cè)LPS會導(dǎo)致大鼠死亡，不宜進(jìn)行乳腺炎治療的相關(guān)研究；乳頭灌注40 μg/側(cè)LPS會出現(xiàn)明顯的充血、出血、水腫和PMN浸潤等炎癥反應(yīng)，適合乳腺炎發(fā)生機(jī)制及治療效果研究。乳頭灌注LPS量越少，炎癥程度越輕。因此，在今后的研究中，可根據(jù)試驗所需乳腺炎炎癥程度的不同要求來選擇不同劑量的LPS制作乳腺炎病理模型。

綜上所述，SD大鼠體積大，便于確定穴位的位置，適合針刺研究，而且能通過控制LPS劑量誘導(dǎo)出批量重復(fù)性好的乳腺炎動物模型。故而本研究為后續(xù)針刺、艾灸、電針及中草藥提取物、激素等治療乳腺炎研究提供了可靠的動物模型，為動物乳腺炎治療機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

不同劑量的LPS能誘導(dǎo)哺乳期SD大鼠不同程度的急性臨床型乳腺炎，乳頭灌注40 μg/側(cè)LPS能引起明顯的乳腺炎癥且不會造成SD大鼠死亡。

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Establishment of LPS-induced Mastitis Model in Lactation SD Rats

XIE Ying-ying1，HU Xue-quan1，CUI Jing-chun2，LI Guang-xing1，GE Ming1，ZHANG Rui-li1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin，Heilongjiang，150030,China; 2.CollegeofLifeSciences,DalianNationalitiesUniversity,Dalian，Liaoning，116600,China)

The present study aimed to make a pathological model of mastitis in SD rats,being the basis of further study of mastitis treatment.30 lactation rats were randomly divided into control group (5 rats) and 5 trial groups (5 rats each group) 72 h after parturition.10，20，30，40，50μg LPS was inoculated into the each side mammary gland through the forth pair of nipples of the rats in trial groups,compared to the control groups with the equal volume of PBS .Exactly 24 h after inoculation，the clinical symptoms of the rats and histopathological lesions of the mammary glands were observed and recorded.The results showed that different inflammatory responses were observed in the forth mammary glands of SD rats,and a dose-dependent correlation was detected between LPS and inflammatory response.The results indicated that LPS-induced mastitis model was successfully constructed in lactation SD rats.

SD rat; lipopolysaccharide; mastitis; pathological model

2016-07-11

國家自然科學(xué)基金項目(31272584)

解穎穎(1989-)，女，河南開封人，碩士，主要從事獸醫(yī)病理學(xué)研究。*通訊作者

S852.3

A

1007-5038(2017)02-0046-05