李昕鍵，吳 徹，雷小亞，嚴(yán)一銘，戴振凱，張新珩，藺文成，陳偉國(guó)，陳 峰，謝青梅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642)

雞心包積液綜合征病原的分離鑒定與進(jìn)化分析

李昕鍵，吳 徹，雷小亞，嚴(yán)一銘，戴振凱，張新珩，藺文成，陳偉國(guó)，陳 峰，謝青梅*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642)

為確診海南省某雞場(chǎng)疑似心包積液綜合征病例，于2016年5月從海南省某雞場(chǎng)送檢的病雞中采集病料(肝臟、心臟)，研磨，通過(guò)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，并進(jìn)行雞胚病變特征觀察、禽腺病毒PCR特異性檢測(cè)、基因測(cè)序和Blast序列比對(duì)。結(jié)果表明,接種雞胚后5 d開(kāi)始死胚，剖檢可見(jiàn)胚體發(fā)育受阻，羽毛稀少，體表潮紅，雞胚皮膚表面有出血點(diǎn)；在病料研磨液、尿囊液及胚體肝臟中均檢測(cè)到大小約為884 bp目的片段，將分離病毒命名為HN1605；hexon基因Blast序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，分離毒株與2015年山東和湖北報(bào)道的Ⅰ亞群腺病毒血清4型(FAV-4)SDSX、SDSX-15、SDNY2-15、HB1510和HBLF-15分離株親緣關(guān)系最近。本研究表明，此次心包積液綜合征病原是Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型病毒，該病毒依然危害著我國(guó)雞群，疫情不斷擴(kuò)大，并呈現(xiàn)由我國(guó)北方地區(qū)向南方地區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì)。

心包積液綜合征；禽腺病毒；分離；鑒定；序列分析

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)是一種無(wú)囊膜雙鏈DNA病毒，屬于腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)其群特異性抗原可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)亞群[1]。Ⅰ亞群根據(jù)交叉中和試驗(yàn)又可分為12個(gè)血清型(FAV1-12),其中Ⅰ亞群FAV中血清4型和10型被認(rèn)為是引起心包積液綜合征、包涵體肝炎的主要病原[2-4]。心包積液綜合征首先發(fā)生于1987年巴基斯坦的安卡拉地區(qū)[5]，隨后在日本、印度、韓國(guó)等國(guó)家均有報(bào)道[3,6-8]，而心包積液綜合征臨床病例在我國(guó)的報(bào)道相對(duì)較少，只有少數(shù)FAV引起包涵體肝炎的報(bào)道[9-10]。2015年6月首先在我國(guó)山東地區(qū)肉雞群暴發(fā)心包積液綜合征疫情，隨后在河南、遼寧、河北、江蘇及湖北等[1,11-12]地區(qū)均出現(xiàn)該癥狀疫情報(bào)道，給我國(guó)肉雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

2016年5月，從海南某大型雞場(chǎng)送檢疑似心包積液病死雞中，采集病雞肝臟、心臟等病料，通過(guò)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，并進(jìn)行雞胚病變特征觀察、禽腺病毒PCR特異性檢測(cè)、基因測(cè)序和Blast序列比對(duì)，成功分離鑒定此次心包積液綜合征病原是Ⅰ群禽腺病毒血清4型病毒，并對(duì)hexon基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和雞胚 2016年5月，從海南省某雞場(chǎng)送檢3只病雞采集肝臟、心臟、肺臟等病料。SPF雞胚購(gòu)自廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 PMD19-T質(zhì)粒、大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、LATaq酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；病毒DNA抽提試劑盒、DNA Gel Extraction Kit ，Omega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 向無(wú)菌采集的病料(肝臟、心臟等組織)加入含10 g/L雙抗的PBS，在研缽中加入液氮充分研磨，反復(fù)凍融3次后，離心取上清液，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，采用卵黃囊接種至7日齡SPF雞胚，0.2 mL /枚,置于37 ℃孵育，每日觀察，連續(xù)觀察7 d。棄去24 h內(nèi)非特異性死亡雞胚，收集24 h后死胚及尿囊液，7 d未死亡雞胚及尿囊液，進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.2.2 病毒DNA提取 利用病毒DNA提取試劑盒，對(duì)病料研磨液、雞胚尿囊液及雞胚肝臟心臟研磨液提取DNA，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank公布的hexon基因序列設(shè)計(jì)用于特異性檢測(cè)引物，上游引物：5′-CAAGTTCAGACAGACGGT-3′，下游引物：5′-TAGTGATGGCGGGACATCAT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段884 bp。參考已報(bào)道Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型hexon基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增hexon全基因序列的引物，上游引物5′-ATGGCGGCCCTCACGCCCGAC-3′，下游引物：5′- GCCACAGGCAACGCCGTGTAA-3′，

預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段2 814 bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.4 PCR特異性檢測(cè)與hexon基因克隆 以1.2.2提取的DNA為模板，利用設(shè)計(jì)合成引物擴(kuò)增hexon目的基因，采用25 μL體系，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，12℃終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳、回收后，克隆至pMD-19T載體上并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α，37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性菌送交金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 序列分析 應(yīng)用DNA Star.Lasergene.v 7.1分析軟件對(duì)測(cè)序得到的基因序列進(jìn)行拼接整理，在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并應(yīng)用MEGA6.06分析軟件進(jìn)行基因的遺傳進(jìn)化分析。用于比較和分析參考序列均下載自GenBank：ON1(NC-015323)、HBLF-15(KU877420)、HB1510(KU587519)、SDSX(KT899325)、SDSX-15(KU877435)、SDNY2-15(KU877433)、SDXT2-15(KU877432)、Fowl adenovirus 10(U26211)、Phelps(U46933)、340(KC493646)、HG(GU734104)、A-2A(AF083975)、ATHEV(AY849321)、HEV(AF074946)、FJ12025(KF286430)、EDS/127(Y09598)、D11-JW-032(KJ452172)。

2 結(jié)果

2.1 雞胚接種結(jié)果

病料接種7日齡SPF雞胚后，24 h內(nèi)未出現(xiàn)特異性死亡雞胚，接種雞胚后5 d～7 d陸續(xù)出現(xiàn)雞胚死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)胚體發(fā)育受阻，羽毛稀少，體表潮紅，雞胚皮膚表面有出血點(diǎn)(圖1)。

a.13 d正常雞胚(未接種); b.13 d接種死亡雞胚; c.14 d正常雞胚(未接種); d.14 d 接種死亡雞胚

2.2 PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)病料研磨液和接胚后5 d～7 d收集的尿囊液及雞胚肝臟心臟組織進(jìn)行禽腺病毒PCR特異性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果由圖2和圖3可知，在病料研磨液和5 d～7 d收集的尿囊液及雞胚肝臟心臟組織中均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符約為884 bp片段，且陰性、陽(yáng)性對(duì)照成立，表明本研究成功分離得到1株禽腺病毒。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; PC.陽(yáng)性對(duì)照;NC.陰性對(duì)照;1～3.病料M.DNA Marker DL 2 000; PC.Positive control;NC.Negative control；1-3.Samples

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; PC.陽(yáng)性對(duì)照;NC.陰性對(duì)照; 1～6.接胚后5 d～7 d尿囊液和雞胚肝臟M.DNA Marker DL 2 000; PC.Positive control;NC.Negative control; 1-6.The allantoic fluid and liver samples on day 5 to 7 post-infection

2.3 hexon基因同源性比較及遺傳進(jìn)化分析

HN1605分離株的hexon基因?yàn)? 814 bp(圖4)，編碼938個(gè)氨基酸殘基。與GenBank上已發(fā)表的不同亞群禽腺病毒參考序列比對(duì)，Blast軟件分析結(jié)果表明,HN1605分離株與Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型序列有較高同源性，其中2015年報(bào)道的同屬于Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型的山東分離株SDXT2-15、SDSX、SDSX-15、SDNY2-15和湖北分離株HB1510、HBLF-15同源性高達(dá)99.9%以上，與2011年報(bào)道加拿大分離株ON1同源性為98.7%，與Ⅰ亞群禽腺病毒血清10型序列同源性為97.2%，而與Ⅰ亞群禽腺病毒血清1、5、8、9型同源性較低(69.3%～76.0%)，與Ⅱ亞群禽腺病毒的火雞出血性腸炎病毒、Ⅲ亞群禽腺病毒的減蛋綜合征同源性僅為49.8%～53.2%(圖5)。

根據(jù)MEGA5.0軟件繪制的遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，HN1605分離株與Ⅰ群腺病毒血清4型毒株處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近；與血清10型親緣關(guān)系較近；而與Ⅱ群禽腺病毒參考毒株及Ⅲ群禽腺病毒參考毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，明顯屬于不同的分支(圖6)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000; 1.hexon基因

3 討論

心包積液綜合征是一種高度傳染性疾病，主要發(fā)生在2周～4周的雞群，造成20%～30%的病死率，與傳染性法氏囊病、雞新城疫、大腸桿菌病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、禽白血病、馬立克病等病發(fā)生混合感染可導(dǎo)致較高死亡率，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)有效疫苗[13]。本研究通過(guò)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，接胚后5 d～7 d后開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)雞胚死亡，雞胚發(fā)育受阻，羽毛稀少，體表潮紅，雞胚皮膚表面有出血點(diǎn)，個(gè)別雞胚肝臟呈現(xiàn)土黃色，與先前Ⅰ亞群禽腺病毒報(bào)道結(jié)果一致[9]。Ⅰ亞群腺病毒PCR特異性檢測(cè)死胚尿囊液和心臟、肝臟均擴(kuò)增出大小約884 bp目的片段；通過(guò)基因測(cè)序和Blast序列比對(duì)，最終確定此次心包積液綜合征病原是Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型病毒。之前報(bào)道也表明許多造成心包積液的病原屬于Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型，并且是高致病性的[4]。

圖5 hexon基因同源性比對(duì)結(jié)果

圖6 hexon基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

目前，該病毒的hexon基因是被研究最廣泛的，Hexon蛋白是Ⅰ亞群腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種屬特異性抗原決定簇，是中和抗體的靶目標(biāo)和主要保護(hù)性抗原基因，與致病性密切相關(guān)[14]。對(duì)hexon基因進(jìn)行序列分析可進(jìn)一步確定分離株屬于FAV哪一個(gè)群，并區(qū)分同一各亞群的不同血清型[15]。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)合成引物，對(duì)HN1605毒株hexon全序列進(jìn)行擴(kuò)增，與已報(bào)道禽腺病毒毒株進(jìn)行比對(duì)，HN1605分離株與Ⅰ亞群腺病毒血清4型毒株處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近；與血清10型親緣關(guān)系較近；而與Ⅱ亞群禽腺病毒火雞出血性腸炎病毒參考毒株、及Ⅲ亞群禽腺病毒減蛋綜合征參考毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，明顯屬于不同的分支；通過(guò)對(duì)HN1605分離株hexon基因比對(duì)分析，進(jìn)一步確定了本次分離毒株屬于Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型。HN1605分離株hexon基因同源性分析表明，與國(guó)內(nèi)2015年報(bào)道的的山東分離株SDXT2-15、SDSX、SDSX-15、SDNY2-15和湖北分離株HB1510、HBLF-15同源性高達(dá)99.9%以上，而HB1510和SDXT2-15等毒株同源性高達(dá)99.8%以上，說(shuō)明HN1605分離株與上述分離株均來(lái)自同一毒株，且變異較小。與FAV-4參考毒株hexon基因核苷酸序列相比，HN1605分離株hexon基因有些核苷酸發(fā)生了突變，這些突變是否與病毒中和反應(yīng)有關(guān)，是否影響病毒致病性仍需要進(jìn)一步研究。本研究在海南省送檢疑似心包積液綜合征的病料中成功分離鑒定出1株Ⅰ亞群禽腺病毒血清4型病毒，為進(jìn)一步研究心包積液綜合征病原奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也提醒我們，“安卡拉”病毒依然危害著我國(guó)雞群，并且疫情呈現(xiàn)由我國(guó)北方地區(qū)向南方地區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì)，這應(yīng)該引起行業(yè)內(nèi)相關(guān)人士的密切關(guān)注。

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Isolation,Identification and Evolution Analysis of a Fowl Adenovirus Serotype 4 Strain from Chickens with Hydropericardium Syndrome

LI Xin-jian,WU Che,LEI Xiao-Ya,YAN Yi-ming,DAI Zhen-kai,ZHANG Xin-heng,LIN Wen-cheng,CHEN Wei-guo,CHEN Feng,XIE Qing-mei

(CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong，510642,China)

In this research,a fowl adenovirus serotype 4 strain named GD1605 was isolated and identified from livers and hearts of sick chickens in a farm of Hainan province in China,May 2016,based on SPF chicken embryo culture,chicken embryo pathological lesions,PCR assay,BLAST and sequence analysis.The results showed that each of inoculated chicken embryo appeared to be dead 5 d to 7d post inoculation and the death embryoes were observed as arrested development,feather scarce and skin hemorrhage.An avian adenovirus-specific PCR product (884 bp) was amplified and sequenced.The genetic evolution analysis results showed that the virus shared high identity with FAV-4 in group Ⅰ.The genetic evolution analysis also indicated that the virus was closely related to the FAV-4(group I) strains of SDSX,SDSX-15,SDNY2-15,HB1510 and HBLF-15.These results confirmed that the isolated virus is a member of fowl adenovirus serotype 4 in group Ⅰ,and causes hydropericardium-hepatitis syndrome.This virus still endangering chicken flocks in China,the epidemic expands unceasingly,and display the trend of epidemic from north to south regions in China.

Hydropericardium-hepatitis syndrome; Fowl adenovirus; isolation; identification; sequence analysis

2016-06-24

李昕鍵(1991-)，男，湖南常德人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物免疫與生物安全研究。*通訊作者

S852.659.1；S858.31

A

1007-5038(2017)02-0027-05