謝秀蘭，馬小明，黎 帥，康曉冬，高?；郏罘f康*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)新華學(xué)院，寧夏銀川 750021)

寧夏部分地區(qū)腹瀉羔羊源大腸埃希菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

謝秀蘭1，馬小明1，黎 帥2，康曉冬1，高?；?，李穎康1*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)新華學(xué)院，寧夏銀川 750021)

為掌握寧夏地區(qū)羔羊腹瀉源大腸埃希菌的耐藥性，采集腹瀉羔羊肛拭子90份，開(kāi)展大腸埃希菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果分離到78株大腸埃希菌，對(duì)頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類、氟苯尼考、青霉素類、四環(huán)素等抗菌藥物有較高的敏感性，對(duì)萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素耐藥(耐藥率78.21%～94.87%)。結(jié)果表明，寧夏地區(qū)羔羊腹瀉源大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物保持較高的敏感率，耐藥現(xiàn)象并不嚴(yán)重。

羔羊；腹瀉；大腸埃希菌；藥敏試驗(yàn)

羔羊腹瀉是羔羊的一種急性腸道傳染病，大腸埃希菌、霉菌、沙門菌、魏氏梭菌、輪狀病毒、球蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)等微生物、寄生蟲(chóng)均可導(dǎo)致羔羊腹瀉[1-2]。此病在世界許多國(guó)家中流行，是造成羔羊成活率低下的主要原因。致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)是引起羔羊腹瀉的最常見(jiàn)的病原因素[3-4]。該病在寧夏地區(qū)發(fā)病率較高，嚴(yán)重危害該地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展，試驗(yàn)針對(duì)寧夏地區(qū)腹瀉羔羊開(kāi)展大腸埃希菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，這對(duì)防治羔羊腹瀉具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 寧夏地區(qū)發(fā)生腹瀉的羔羊的糞便肛拭子，插入1支C-B運(yùn)輸培養(yǎng)基，12 h 內(nèi)實(shí)驗(yàn)室送檢。

1.1.2 試劑與儀器 藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL 2 000、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基等培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；脫纖維綿羊血，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；VITEK 2革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡、梅里埃VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；電子比濁儀(DensiCHEK Plus)，美國(guó)BioMerieux公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌的分離鑒定 無(wú)菌操作，將肛拭子分別分區(qū)劃線接種SS瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、綿羊血平板，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察菌落形態(tài)特征，挑取典型菌落，接種SS瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂平板純培養(yǎng)，并進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌鑒定。取純培養(yǎng)物涂片，革蘭染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 VITEK2 Compact的細(xì)菌鑒定 在滅菌的4.5 g/L生理鹽水中，加入菌液，電子比濁儀調(diào)整其濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，插入革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡，應(yīng)用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3 細(xì)菌16 S rRNA鑒定 16 S rRNA基因擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物，序列為：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

提取純化培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃4 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并與GenBank中大腸埃希菌的16 S rRNA基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 腸致病性大腸埃希菌(EPEC)和腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)的PCR檢測(cè) 按照文獻(xiàn)[5]記載的引物，進(jìn)行腸致病性大腸埃希菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)和腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)的PCR檢測(cè)。

EPEC檢測(cè)eae A基因，引物序列為：TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT；GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG；目的片段482 bp；

ETEC檢測(cè)LT基因，引物序列為：TCTCTATGTGCATACGGAGC；CCATACTGATTGCCGC- AAT；目的片段322 bp；

EPEC和ETEC的PCR反應(yīng)體系相同，25 μL反應(yīng)體系，Master PCR mix 12.5 μL,上游引物 1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL；EPEC的反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，30 cycles；72℃ 10 min；ETEC的反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，30 cycles；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，吸取30 μL菌液，置于普通瓊脂培養(yǎng)基中央，用涂布棒將菌液均勻涂于培養(yǎng)基表面，至菌液被完全吸收后，將不同的藥敏片貼在培養(yǎng)基的適當(dāng)位置，置于37℃培養(yǎng)箱中18 h ～24 h，觀察抑菌情況，判定依照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 病原的分離、培養(yǎng)與鏡檢

分離得到的78株細(xì)菌，其中表現(xiàn)β型溶血的有9株，不溶血的有69株，細(xì)菌在SS平板上形成紅色菌落(圖1A)；部分分離菌在綿羊血平板上形成β溶血環(huán)(圖1B)，傳代后溶血環(huán)會(huì)消失；EMB平板上形成具有金屬光澤菌落(圖1C)；分離菌經(jīng)革蘭染色后鏡檢，可見(jiàn)革蘭陰性的紅色小桿菌(圖1D)。

A.SS平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象; B.血平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象; C.EMB上生長(zhǎng)現(xiàn)象; D.革蘭染色后鏡檢(100×)

2.2 VITEK2 Compact的細(xì)菌鑒定

分離菌的純培養(yǎng)物經(jīng)VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，為大腸埃希菌。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的分離菌基因?yàn)槟０?，用合成的通用引物擴(kuò)增分離菌16 S rRNA基因，擴(kuò)增出大小約為1 504 bp目的片段，與預(yù)期大小相符(圖2)。PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)，同源性最高的序列均為大腸埃希菌各株系的1 6S rRNA，同源性為100%。

2.4 EPEC、ETEC檢測(cè)結(jié)果

以提取的分離菌基因?yàn)槟０?，分別用ETEC、EPEC引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小分別為322 bp和482 bp的片段，與預(yù)期大小相符(圖3A和B)。EPEC檢測(cè)出66株，占84.62%；ETEC沒(méi)有檢測(cè)到。

2.5 藥敏試驗(yàn)

78株大腸埃希菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。從結(jié)果可以看出，大腸埃希菌具有多重耐藥性，對(duì)克林霉素、萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率最高，分別為94.87%、84.62%和78.21%。對(duì)頭孢類抗生素具有較高的敏感性，頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢氨芐、頭孢拉定的敏感率分別為89.74%、89.74%、87.18%、83.33%和82.05%。氨基糖苷類抗生素，阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素的敏感率分別為88.46%、78.21%和75.64%。青霉素類抗生素，哌拉西林、氨芐西林、阿莫西林的敏感率分別為74.36%、70.51%和66.37%；喹諾酮類抗菌藥物，氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的敏感率分別為82.05%、74.36%和71.79%；氟苯尼考的敏感率為76.92%，四環(huán)素的敏感率為62.82%。紅霉素和恩諾沙星為中度敏感。耐藥的抗菌藥物占13.63%(3/22)，敏感的抗菌藥物占77.27%(17/22)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～6.分離菌的16 S rRNA PCR產(chǎn)物；7.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000；1-6.16 S rRNA PCR products of isolates；7.Negative control

M1.DNA Marker DL 2 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2～21.部分臨床樣品；22.陰性對(duì)照；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

藥物名稱Drugs敏感/株Sensitivity中介/株Moderateresistance耐藥/株Resistance耐藥率/%Drugresistancerate敏感率/%Drugsensitiverate阿米卡星Amikacin69456．4188．46哌拉西林Piperacillin5831721．7974．36慶大霉素Gentamicin6151215．3878．21紅霉素Erythromycin1502734．621．28頭孢曲松Ceftriaxone70267．6989．74氨芐西林Ampicillin5522126．9270．51恩諾沙星Enrofloxacin9511823．0811．54阿莫西林Amoxicillin5262025．6466．67氧氟沙星Ofloxacin645911．5482．05氟苯尼考Florfenicol6041417．9576．92諾氟沙星Norfloxacin5931620．5174．36頭孢拉定Cefradine6431114．1082．05頭孢唑林Cefazolin70178．9789．74頭孢噻肟Cefotaxime682810．2687．18萬(wàn)古霉素Vancomycin846684．6210．26頭孢氨芐Cefalexin6531012．8283．33鏈霉素Streptomycin5712911．5473．08四環(huán)素Tetracycline4912835．9062．82環(huán)丙沙星Ciprofloxacin5651721．7971．79卡那霉素Kanamycin5911810．2675．64復(fù)方新諾明Co?trimoxazole2156178．212．56克林霉素Clindamycin137494．871．28

3 討論

大腸埃希菌本身極易產(chǎn)生耐藥性，加之抗菌藥物的濫用致使飼養(yǎng)環(huán)境中耐藥菌株越來(lái)越多。國(guó)內(nèi)不少學(xué)者開(kāi)展了羔羊腹瀉源大腸埃希菌的耐藥試驗(yàn)，張希利等[1]對(duì)新疆阿勒泰地區(qū)羔羊腹瀉病的研究結(jié)果表明，分離的大腸埃希菌對(duì)左氟沙星、新霉素、頭孢噻呋、甲硝唑敏感，對(duì)卡拉霉素、慶大霉素、阿莫西林、土霉素、磺胺嘧啶具有耐藥性；楊耀等[2]研究甘南州藏羔羊腹瀉大腸埃希菌K99株對(duì)硫酸黏菌素、恩諾沙星、氯霉素極敏；對(duì)頭孢三嗪、氟哌酸、丁胺卡那霉素高敏；對(duì)慶大霉素、妥布霉素中敏；對(duì)青霉素、鏈霉素、復(fù)合磺胺等不敏感；夏利寧等[4]從新疆規(guī)模化養(yǎng)羊場(chǎng)糞便中分離出638株大腸埃希菌，對(duì)安普霉素和阿莫西林/克拉維酸鉀耐藥率高達(dá)33.9%和21.2%；對(duì)氟苯尼考最敏感，耐藥率僅為3.1%；其余的藥物耐藥率在7.5%～15.6%。東主措[6]研究發(fā)現(xiàn)青海省海南州的1例羔羊大腸埃希菌對(duì)鏈霉素、氯霉素耐藥性最高，頭孢哌酮、阿米卡星、頭孢噻肟為敏感藥物。本試驗(yàn)中，78株羔羊腹瀉源大腸埃希菌對(duì)常用22種抗生素表現(xiàn)不同，對(duì)克林霉素、萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率最高；敏感率較高的抗菌藥物共計(jì)17種，依次為頭孢類、氨基糖苷類、青霉素類、喹諾酮類、氟苯尼考和四環(huán)素，敏感抗菌藥物數(shù)量占77.27%，表明寧夏地區(qū)羔羊腹瀉源大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物保持較高的敏感率，耐藥現(xiàn)象不嚴(yán)重。

致病性大腸埃希菌和非致病性大腸埃希菌在培養(yǎng)特性和生化反應(yīng)等方面相似，但致病性大腸埃希菌具有特殊的血清型、腸毒素或毒力因子。EPEC引起的病變是黏附與脫落，由eae基因編碼的緊密素外膜蛋白是引起。ETEC的2個(gè)主要毒力因子是黏附素和腸毒素，腸毒素依據(jù)其生物學(xué)特性被分為不耐熱腸毒素和耐熱性腸毒素[7]。本試驗(yàn)通過(guò)PCR方法測(cè)定分離菌株的毒力因子和腸毒素基因片段，78株大腸埃希菌分離株中檢測(cè)到了66株EPEC，數(shù)量最多，沒(méi)有檢測(cè)到ETEC,表明寧夏地區(qū)羔羊腹瀉源大腸埃希菌主要類型為EPEC。

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofE.colifrom Lambs with Diarrhea in Ningxia Region

XIE Xiu-lan1，MA Xiao-ming1，LI Shuai2，KANG Xiao-dong1，GAO Hai-hui1，LI Ying-kang1

(1.InstituteofAnimalScience，NingxiaAcademyofAgricultureandForestrySciences,Yinchuan,Ningxia,750002，China；2.XinhuaCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia，750021，China)

In order to understand the drug resistance of the lamb diarrheaE.coliin Ningxia region,90 anal swab samples were collected to isolate and identifyE.coli,and test the drug sensitivity.Results showed that 78 strains ofE.coliwere isolated.Isolates ofE.coliwere sensitive to cephalosporin antibiotics,aminoglycoside antibiotics,quinolones,fluorine benzene nicol,penicillin class,tetracycline,and resistant to vancomycin，compound trimolazole and clindamycin.The results suggested thatE.coliisolated from lambs with diarrhea in Ningxia region kept high sensitivity rate to antimicrobials.

lamb; diarrhea;Escherichiacoli; drug sensitivity test

2016-04-28

寧夏農(nóng)林科學(xué)院先導(dǎo)基金項(xiàng)目(NKYJ-14-10)

謝秀蘭(1980-)，女(回族)，寧夏平羅人，副研究員，碩士，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.612;S858.26

B

1007-5038(2017)02-0116-04