林夢雨，尹雁斌，陳 韜

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

專論與綜述

血管生成素4的研究進(jìn)展

林夢雨，尹雁斌，陳 韜※

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

斷奶仔豬的腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)一直以來的難題，ANG4(Angiogenin 4，血管生成素 4)是一種由腸道細(xì)胞分泌多肽類蛋白，具有抗菌、減緩炎癥發(fā)生、促血管生成及維持腸道粘膜屏障完整的作用，在防治仔豬斷奶方面具有廣闊的前景。文章對 ANG4的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)以及作用機(jī)制等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

血管生成素 4；血管生成作用；抗菌肽；腸道炎癥

1 ANG 家族的發(fā)現(xiàn)

上個世紀(jì) 70 年代，F(xiàn)olkman 等發(fā)現(xiàn)微血管構(gòu)成是實體腫瘤形成、發(fā)展和遷移過程中極為重要的步驟，還證實了腫瘤細(xì)胞能分泌一種生物因子刺激腫瘤內(nèi)新的血管網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生，并將這種生物因子命名為血管生成素(Angiogenin,ANG)。1985 年，這種調(diào)節(jié)因子首次在人類的結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT-29 細(xì)胞培養(yǎng)上清中被發(fā)現(xiàn)[1]。

ANG 含有 123 個氨基酸殘基，是一種分泌性單鏈蛋白，相對分子質(zhì)量約為 14kD，ANG 與胰核糖核酸酶的氨基酸序列有 35%的一致性，晶體結(jié)構(gòu)也極為相似[2]。ANG 屬于核糖核酸酶超家族(RNase, ribonuclease A family)， 具 有較 低 的核 糖 核 酸酶活性，而且與其他 RNase 超家族基因一樣均定位于14 號染色體上[3]，ANG 是目前已知所有血管生成因子中唯一具備核糖核酸酶活性的調(diào)節(jié)因子，也是核糖核酸酶超家族中唯一具備促血管生成能力的成員。

此后對 ANG 的進(jìn)行的一系列研究發(fā)現(xiàn) ANG是一系列分泌型的生長因子，目前鼠源ANG家族主要由 angiogenin-relatedprotein（mANGRP,renamed mANG2）、mANG3、mANG4、mANG5 和 mANG6 五種類型組成[4]，該家族成員廣泛存在于生物機(jī)體多種組織中，表明了 ANG家族成員不僅具有促血管生成作用，可能還具有其他生理功能。其中本文研究的 ANG4是一種在動物腸道內(nèi)主要由杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞分泌的蛋白，ANG4 含有 144 個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為 16 kD，其基因與其他家族成員一樣，也定位于 14 號染色體[3]。

2 ANG4 的生理功能

ANG在血管形成和腫瘤發(fā)展過程中的重要作用早已被發(fā)現(xiàn)，但很多研究表明ANG除血管生成作用以外還具有更多的生理功能，其家族成員中的ANG4不僅在體外不僅表現(xiàn)出一定的促血管生成能力，還能促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增值，但無法促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增值和遷移[4]，另外還有很多研究發(fā)現(xiàn) ANG4的表達(dá)與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，所以 ANG4異常表達(dá)可能對腸道炎癥的發(fā)生具有重要指示意義，其家族成員中的 hANG(人源的血管生成素)、mANG1(鼠源血管生成素 1)都具有一定的抗菌作用[5]。這也是本文探討的重點(diǎn)，一種可能替代抗生素殺滅細(xì)菌的新型抗菌肽。

研究表明 ANG4在小鼠小腸內(nèi)的潘氏細(xì)胞、結(jié)腸的杯狀細(xì)胞和胰腺中均有表達(dá)，且在潘氏細(xì)胞中表達(dá)受到腸道微生物群的影響，另外 ANG4 不僅參與了腸道血管的生成過程，還表現(xiàn)出能選擇性殺死一些腸道病原微生物的特性，這表明了 ANG4在腸道的先天性免疫體系中扮演了重要的角色。ANG4對糞腸球菌和李斯特氏菌（兩種都是革蘭氏陽性菌）具有強(qiáng)力的殺菌效果，對多形擬桿菌（腸道中的一種常見細(xì)菌）則不敏感，此外 K12 大腸桿菌和非致病性李斯特氏菌則對 ANG4 有明顯的抵抗力[5]。這表明ANG4能選擇性的殺死有害的病原微生物。

另外與 ANG4 同屬于 RNaseA 超家族的某些其他成員也表現(xiàn)出與之相類似的殺菌功能，嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（Eosinophil cationic protein,ECP, RNase3）對金黃葡萄球菌和埃希氏大腸桿菌具有中等殺菌活性，ECP 除了殺菌活性以外還具有其他抗病原體活性，包括殺蟲活性和對真核細(xì)胞的毒性[6]。 RNase7 和 RNase8 都 具 有 很 強(qiáng) 的 廣 譜 殺 菌 活性，即使在很低的微摩爾濃度下也能抑制甚至殺死例如金黃色釀膿葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌、屎腸球菌和綠 濃桿菌等細(xì)菌[7,8]。另外人 ANG 和小鼠ANG1 也都具有微弱的殺菌活性，從家雞中分離出來的 RNaseA-2 以及從斑馬魚中克隆表達(dá)的三種核糖核酸酶重組蛋白 （DrRNase1,DrRNase2,Dr-RNase3）都具有較為明顯的殺菌活性[9]。雖然這些成員的殺菌機(jī)制各有差異，但是卻在某一些機(jī)制上有類似之處甚至是共同之處。

有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠感染了鼠鞭毛蟲后，小鼠腸道內(nèi)的潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞會大量分泌 ANG4，在此過程中，調(diào)節(jié) ANG4表達(dá)的關(guān)鍵因素是多種白細(xì)胞介素的分泌刺激，其中最為關(guān)鍵的是 IL-13 和IL-25，這兩種白細(xì)胞介素都是強(qiáng)力的抗炎因子，能有效的抑制炎癥發(fā)生，而且還具有修復(fù)腸道損傷的功能[10,11]。但是 IL-13 和 IL-25 誘導(dǎo) ANG4 的過程中又涉及到多種 Toll受體（Toll like recepto,TLR）介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路[11]，而 TLR 介導(dǎo)的信號通路通常是促使炎癥的發(fā)生以激活宿主的免疫防御[12]。因此ANG4和上文提到的人 ANG一樣，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的發(fā)展中起到作用可能與炎癥發(fā)生的狀態(tài)密切相關(guān)，但是毋庸置疑的是 ANG4在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的過程中起到了極為重要的作用，并且可能還具有維持腸道完整性的功能。

3 ANG4 的表達(dá)調(diào)控

Hooper LV 等[5]利用 qRT-PCR 技術(shù)對小鼠內(nèi)ANG的 mRNA進(jìn)行辨別，在小鼠的小腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ANG4 mRNA，此后還利用了激光捕獲顯微切割技術(shù)對小腸內(nèi)的潘氏細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了在小鼠小腸內(nèi)，潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞是ANG4主要的表達(dá)場所。

另外 Hooper LV 等[5]以不同方式喂養(yǎng)生理狀相同的無菌小鼠后，發(fā)現(xiàn)了 ANG4的表達(dá)極有可能受到腸道微生物群的影響。當(dāng)以無菌方式喂養(yǎng)無菌小鼠時，其體內(nèi)幾乎檢測不到 ANG4 的表達(dá)，而以無菌方式喂養(yǎng)只定植了多形擬桿菌的無菌小鼠，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)ANG4的表達(dá)遠(yuǎn)低于正常飼養(yǎng)的正常小鼠，當(dāng)以常規(guī)方式喂養(yǎng)無菌小鼠時，其體內(nèi) ANG4 的表達(dá)量與正常小鼠無異[5]。

另外ANG4的表達(dá)還受到病原菌產(chǎn)物的影響，尤其是某些革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖(Lipopolyoaccharide,LPS)成分會上調(diào) ANG4 的表達(dá)。用 LPS 處理從小鼠體內(nèi)分離出的腸道腺窩，結(jié)果顯示細(xì)菌的脂多糖能明顯刺激小腸隱窩中 ANG4和溶酶菌的分泌，其作用機(jī)制可能與 TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[5]。TLR 分布在機(jī)體內(nèi)絕大多數(shù)組織內(nèi)，它們能特異性識別某些病原微生物和其產(chǎn)物具有的特殊結(jié)構(gòu)，能過對不同病原微生物進(jìn)行辨別并發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生一些特殊信號從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在先天性免疫防御中起到極為關(guān)鍵的作用[12]，其中 TLR4 是介導(dǎo)內(nèi)毒素 /脂多糖應(yīng)答的最主要受體，TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也是目前發(fā)現(xiàn)最重要的炎性通路之一[13]。這一系列實驗表明了 ANG4 的表達(dá)受到了腸道微生物群的影響，也從側(cè)面表明 ANG4也參與了腸道的免疫反應(yīng)。

ANG4最早在小腸的潘氏細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，此后的研究也發(fā)現(xiàn)在大腸中也有 ANG4的蹤跡，并有相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)在缺乏潘氏細(xì)胞的大腸內(nèi)，杯狀細(xì)胞是ANG4主要的表達(dá)場所。另外有研究發(fā)現(xiàn)在斷奶 14天的小鼠體內(nèi) ANG4的表達(dá)量明顯低于斷奶 28 天的 小鼠[14]，這可能 與潘氏細(xì) 胞 在 小鼠體 內(nèi)的發(fā)育過程有關(guān)，小鼠體內(nèi)的潘氏細(xì)胞通常在其出生后的三到四周時發(fā)育完全[15]，而潘氏細(xì)胞又是ANG4的主要表達(dá)場所之一。

此外還發(fā)現(xiàn)了 ANG4的表達(dá)受到某些白細(xì)胞介素的影響，ANG4 在腸道內(nèi)的表達(dá)受到 TLR4、IL-13 和 IL-4 等因素的影響，其中 IL-13 的參與是ANG4 表達(dá)上調(diào)必不可少的因素[16]。在皮膚組織產(chǎn)生抗菌肽以及腸道發(fā)生炎癥激活T淋巴細(xì)胞時，IL-22 與 IL-17 的參與是必不可少的前提條件[9]，而當(dāng)腸道發(fā)生炎癥時 ANG4 的表達(dá)量會明顯上升[17]。此外 Zannatun Noor 等人進(jìn)行的一系列研究發(fā)現(xiàn)在IL-25 調(diào)節(jié) ANG4 的表達(dá)的過程中，IL-13 起到了至關(guān)重要的作用。

IL-25 也是一種 Th2 型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并且能誘導(dǎo)非 T細(xì)胞、非B細(xì)胞及造血干細(xì)胞的分化，從而啟動免疫反應(yīng)，進(jìn)而驅(qū)除腸道寄生蟲[10]。小鼠感染旋毛蟲后，在驅(qū)除蠕蟲的同時，IL-25 不僅發(fā)揮著保護(hù)機(jī)體的作用，還促使了 ANG4的表達(dá)上調(diào)[18]。IL-25 促使 ANG4 表達(dá)量增加的機(jī)制不僅在驅(qū)除腸道寄生蟲時發(fā)揮著重要作用，在腸道發(fā)生炎癥時也起到了重要的作用。IL-25 能特異性的誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的侵潤并激活 Th2 細(xì)胞的應(yīng)答，上調(diào)IL-4、IL-5、IL-13 等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，而這些細(xì)胞因子都是強(qiáng)力的抗炎因子[19]。其中 IL-25 誘導(dǎo)IL-13 表達(dá)水平上調(diào)的機(jī)制對 ANG4 的表達(dá)起到了至關(guān)重要的作用。

IL-13 是由 Th2 型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，研究表 明 IL-13 能 全 面 抑 制 促 炎 癥 細(xì) 胞 因 子 IL-1、IL-8、IL-12 等合成，能促進(jìn)抗炎癥細(xì)胞因子 IL-1ra的產(chǎn)生。IL-13 還能通過影響腸道上皮細(xì)胞的凋亡，緊密連接以及腸道修復(fù)功能，從而緩解腸道炎癥引起的腸道屏障的損傷[20]。而 IL-13 能誘導(dǎo) ANG4 的表達(dá)，也從側(cè)面說明 ANG4可能在腸道炎癥起到抑制炎癥發(fā)生及維持腸道屏障完整的作用。

Zannatun Noor 等[18]進(jìn) 行 的 一 系 列 實 驗 也 表明IL-25、IL-13 在 ANG4 表達(dá)過程中起到了關(guān)鍵作用，Zannatun Noor 等人用不同的試劑處理了生理狀態(tài)相近的實驗小鼠，其中對照組用 PBS 處理，實驗組用重組 IL-25 每天腹腔注射 0.5 g 處理 10 天。最后發(fā)現(xiàn)實驗組體內(nèi)的 ANG4的表達(dá)量超過了對照組 100 多倍。由此可以推測 IL-25 與 IL-13 是調(diào)控ANG4 表達(dá)的重要因子。從這些研究可以發(fā)現(xiàn)ANG4作為一種由腸道上皮細(xì)胞分泌的抗菌肽，在維持腸道穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著重要重作用。

4 小結(jié)

ANG家族蛋白作為一類新型抗菌肽，它不僅能選擇性的殺死致病菌而不損害有益的共生菌，并且對于腸道菌群容易受到環(huán)境影響而發(fā)生紊亂的斷奶仔豬而言，ANG 家族蛋白能夠維持腸道微環(huán)境的菌群穩(wěn)定。另外在腸道炎癥發(fā)生時ANG4與多種白細(xì)胞介素的相互作用預(yù)示著 ANG4在炎癥發(fā)生時也起著重要作用。雖然目前對ANG4的研究已取得一些成果，但對其生物作用仍存在一些爭議，另外對 ANG4具體的表達(dá)機(jī)制以及抗菌機(jī)理也有待研究，ANG4是否還有其他作用也不能確定。不過就目前 ANG4表現(xiàn)的出的血管生成作用、抗菌作用及在腸道炎癥發(fā)生時的重要作用，可以預(yù)知ANG4在畜牧養(yǎng)殖這一方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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S851;R457

A

1006-4907（2017）03-0043-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.03.019

2017-06-06

林夢雨（1996～），女，漢族，本科生，linmenyu96@163.com。

※通迅作者:陳 韜（1969～），男，教授，博士，主要從事動物腸道粘膜免疫分子生物學(xué)研究，chentao_114@163.com。