倪艷波 張立霞 崔大鵬 張妍霞 趙 敏 楊 靜 李 琳

(濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

灰樹花多糖對人肺腺癌細胞株A549線粒體的影響

倪艷波 張立霞 崔大鵬 張妍霞 趙 敏 楊 靜 李 琳

(濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

目的 檢測人肺癌細胞株A549的細胞增殖、線粒體呼吸水平及線粒體膜電位，觀察灰樹花多糖對A549線粒體的影響。方法 CCK-8法檢測A549細胞增殖，線粒體呼吸系統(tǒng)檢測細胞線粒體呼吸水平，MitoTracker Red CMXRosb線粒體熒光探針、羅丹明123(Rh123)檢測線粒體膜電位。結(jié)果 CCK-8檢測細胞增殖顯示0.4%的灰樹花多糖即可抑制A549細胞的增殖，0.6%灰樹花多糖作用4 h 后，絕大多數(shù)A549細胞死亡，其結(jié)果與對照組相比較有顯著差異(P<0.05)；線粒體呼吸系統(tǒng)結(jié)果顯示，0.4%灰樹花多糖作用于A549細胞4 h 后細胞呼吸微弱；熒光顯微鏡觀察細胞狀態(tài)、線粒體熒光探針染色顯示，0.4%、0.6%灰樹花多糖組部分細胞凋亡，細胞收縮呈圓形，強熒光表達；流式細胞儀檢測線粒體膜電位顯示，0.4%、0.6%灰樹花多糖組熒光信號增強。結(jié)論 灰樹花多糖可以抑制A549的增殖，其作用機制與線粒體膜電位的耗散相關(guān)。

灰樹花多糖；A549；線粒體

A549細胞系是人肺腺癌細胞系，是研究肺癌與肺纖維化的常用細胞系，以轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1誘導A549細胞出現(xiàn)上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化是肺纖維化體外研究的常用方法〔1，2〕。本研究觀察灰樹花多糖對A549細胞轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥品及儀器 肺腺癌細胞株A549，購自中科院上海細胞庫。灰樹花多糖，浙江方格藥業(yè)有限公司，純度50%；線粒體熒光探針，MitoTracker Red CMXRosb，美國Invitrogen公司；羅丹明123(Rh123)，南京凱基生物科技有限公司；凱基新型四唑單鈉鹽法檢測試劑盒，南京凱基生物科技有限公司。IX71倒置熒光顯微鏡，奧林巴斯株式會社；流式細胞儀，貝克曼庫爾特XL；全波段酶標儀，美國Molecular Devices；線粒體呼吸系統(tǒng)Oxygraph-2k，奧地利Oroboros。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰樹花多糖溶液配制 將1 g灰樹花多糖加至50 ml生理鹽水中，用300目濾網(wǎng)過濾一遍，高壓消毒備用。

1.2.2 實驗分組 0.2%，0.4%，0.6%灰樹花多糖組：分別將10、20、30 μl配制好的灰樹花多糖溶液加入完全培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清)至100 μl。以完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)組為對照組。

1.2.3 細胞增殖檢測 將100 μl A549細胞加入96孔板中，培養(yǎng)24 h后至倒置顯微鏡上觀察細胞狀態(tài)，將原培養(yǎng)基吸出，各組分別加入10、20、30 μl灰樹花多糖溶液及完全培養(yǎng)基，放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，向每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育4 h，至全波段酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.4 線粒體呼吸系統(tǒng)檢測 A549細胞接種至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)細胞至85%鋪滿培養(yǎng)瓶底，以0.4%的濃度加灰樹花多糖作用4 h，以完全培養(yǎng)基為對照組，收取細胞，離心，PBS洗一次，兩組分別取200 μl細胞加入已經(jīng)平衡好的線粒體呼吸系統(tǒng)檢測A、B池內(nèi)，檢測細胞線粒體呼吸水平。

1.2.5 MitoTracker Red CMXRosb檢測 將100 μl A549細胞爬片，培養(yǎng)24 h后，以0.2%，0.4%，0.6%的濃度加灰樹花多糖，完全培養(yǎng)基作對照，放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，向每孔加入MitoTracker Red CMXRosb 10 μl，孵育30 min后至倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 流式細胞儀檢測線粒體膜電位 A549細胞種至6孔板中，培養(yǎng)細胞至近80%鋪滿培養(yǎng)板底，以0.2%、0.4%、0.6%灰樹花多糖的濃度加灰樹花多糖，完全培養(yǎng)基作對照，加入Rh123(5 μg/ml，1 ml)孵育10 min，胰酶消化，收集細胞，離心去上清，加PBS沖洗一遍，流式細胞儀上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行析因分析。

2 結(jié) 果

2.1 A549細胞增殖情況 與對照組(1.12±0.33)相比較，0.2%灰樹花多糖組細胞增殖(0.98±0.306)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，0.4%灰樹花多糖組細胞增殖(0.816±0.16)差異顯著(0.01

2.2 A549細胞線粒體呼吸水平 線粒體呼吸系統(tǒng)顯示，0.4%灰樹花多糖組氧耗量平均值為48.07 pmol·s-1·ml-1，明顯低于對照組氧耗量(63.5 pmol·s-1·ml-1)。

2.3 A549細胞生長狀態(tài)線粒體熒光探針染色觀察 加不同濃度的灰樹花多糖培養(yǎng)4 h后至倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，0.2%灰樹花多糖組與對照組細胞狀態(tài)好，形狀無改變；0.4%灰樹花多糖組細胞量較對照組少，大多數(shù)細胞形狀無改變，部分細胞凋亡，凋亡細胞形狀收縮呈圓形；0.6%灰樹花多糖組大多數(shù)細胞凋亡或死亡，貼壁細胞數(shù)少，極少數(shù)細胞保持A549細胞的原有形狀。倒置熒光顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)正常細胞熒光染色均勻，可見清晰的細胞核，凋亡細胞小，呈圓形，熒光強度較正常細胞強，未見細胞核。見圖1。

圖1 細胞培養(yǎng)狀態(tài)與線粒體熒光探針染色(×100)

2.4 流式細胞儀檢測A549細胞膜電位 Rh123染色，流式細胞儀檢測，對照組與0.2%灰樹花多糖組熒光信號強度幾乎相同，0.4%灰樹花多糖組熒光信號強度稍強，0.6%灰樹花多糖組熒光信號強度較其他組強、流式峰圖明顯右移。見圖2。

圖2 Rh123染色檢測線粒體膜電位(Overlay)

3 討 論

灰樹花又名貝葉多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈等，其營養(yǎng)豐富，含有生物活性物質(zhì)，具有獨特的營養(yǎng)和藥用價值?；覙浠ê羞€原糖、甘露糖、葡聚糖，以葡聚糖為主〔3〕。實驗研究表明，從灰樹花子實體提取的多糖具有抗腫瘤作用，并有一定預防腫瘤的效果，目前對于抗腫瘤的研究主要集中在卵巢癌、乳腺癌等〔4～6〕，對于肺癌的研究相對較少。本研究用CCK-8法研究灰樹花多糖對人肺腺癌細胞A549細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)較大劑量的灰樹花多糖可以抑制A549細胞的增殖，甚至造成A549細胞的大量凋亡及死亡。CCK-8法檢測細胞增殖是一種較以前常用研究細胞增殖的方法MTT操作簡便，穩(wěn)定性、重復性更高的檢測方法〔7〕。線粒體呼吸系統(tǒng)又稱高分辨呼吸測定系統(tǒng)，可以對培養(yǎng)細胞、人體組織等進行呼吸測定。本研究0.4%灰樹花多糖組與對照組取相同的細胞量進行呼吸測定，發(fā)現(xiàn)0.4%灰樹花多糖組耗氧量低，該組細胞呼吸微弱。細胞或組織呼吸微弱可能是由細胞凋亡，線粒體或新陳代謝疾病，過氧應激等病理現(xiàn)象導致，結(jié)合其他實驗結(jié)果，考慮細胞呼吸水平的減弱與灰樹花多糖促進A549細胞的細胞凋亡相關(guān)，細胞凋亡與線粒體膜電位的耗散具有密切的相關(guān)性。MitoTrackers Red選擇性聚集在線粒體，與線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)生成穩(wěn)定的生物共軛體，實現(xiàn)對線粒體的穩(wěn)定的熒光染色，其積累取決于膜電位，是常用的線粒體檢測染料之一〔8〕。Rh123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑〔9〕。本研究提示灰樹花多糖會影響A549細胞的體外增殖，其作用與線粒體膜電位的耗散相關(guān)。

1 黃珍姐，鄭金旭，湯 艷，等.肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其信號轉(zhuǎn)導途徑在肺纖維化中的作用〔J〕.臨床肺科雜志，2011；16(6)：823-6.

2 黃 敏，楊惠芳，陳 楠，等.百草枯誘導A549細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及四氫吡咯二硫化氨基甲酸酯的干預作用〔J〕.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2013；39(6)：321-7.

3 李 磊，王衛(wèi)國，郭彥亮，等.灰樹花多糖的制備與其生物活性研究進展〔J〕.食品工業(yè)科技,2009;30(11)：327-31.

4 Soares R，Meireles M，Rocha A，etal.Maitake(D fraction) mushroom extract induces apoptosis in breast cancer cells by BAK-1 gene activation〔J〕.J Med Food，2011;14(6)：563-72.

5 Jiang J，Sliva D.Novel medicinal mushroom blend suppresses growth and invasiveness of human breast cancer cells〔J〕.Int J Oncol，2010;37(6)：1529-36.

6 Martin KR，Brophy SK.Commonly consumed and specialty dietary mushroomsreduce cellular proliferation in MCF-7 human breast cancer cells〔J〕.Exp Biol Med(Maywood)，2010;235(11)：1306-14.

7 熊建文，肖 化，張鎮(zhèn)西.MTT 法和CCK-8法檢測細胞活性之測試條件比較〔J〕.激光生物學報，2007;16(5)：559-62.

8 葛楊楊，谷 慶，馬長生，等.MLN2238對宮頸癌HeLa細胞生長抑制和放射增敏及其機制探討〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2014;21(4)：246-51.

9 Blattner JR，He L，Lemasters JJ.Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader〔J〕.Anal Biochem，2001；295(2)：220-6.

〔2015-09-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

山東省自然科學基金項目(ZR2013HL002)；煙臺市科技發(fā)展計劃項目(2012129)；濱州醫(yī)學院科技重點計劃(BY2013KJZD04，BY2012KJZD10)

張立霞(1981-)，女，碩士，高級實驗師，主要從事食用菌多糖實驗研究。

倪艷波(1979-)，男，碩士，講師，主要從事灰樹花多糖藥理作用研究。

R965.1

A

1005-9202(2017)03-0542-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.009