付傳恒　戶莊　常亮

【摘要】 目的：探討Angiopoietin-2和Tie-2在人乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌組織和正常乳腺組織中Angiopoietin-2和Tie-2的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后間的相關(guān)性。結(jié)果：Angiopoietin-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.99%（98/121）、10.53%（4/38），Tie-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.21%（91/121）、15.79%（6/38），乳腺癌中Angiopoietin-2和Tie-2的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常乳腺組織（P<0.05）。Angiopoietin-2、Tie-2的表達(dá)與病理分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，其可能成為預(yù)測(cè)乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌； Angiopoietin-2； Tie-2； 預(yù)后

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of Angiopoietin-2 and Tie-2 in human breast cancer.Method：The expressions of Angiopoietin-2 and Tie-2 in breast cancer tissues and normal breast tissues were detected by immunohistochemistry，and their correlation with clinicopathological features were analyzed.Result：The positivity rates of Angiopoietin-2 and Tie-2 in breast cancer tissue were 80.99%（98/121） and 75.21%（91/121），there were significantly higher than those of the adjacent normal tissues （10.53% and 15.79%，P<0.05）.The expression of Angiopoietin-2 and Tie-2 were correlated with pathological stage，axillary lymph node metastasis and prognosis（P<0.05）.Conclusion：Angiopoietin-2 and Tie-2 are highly expressed in breast cancer tissues，which may be biomarkers for predicting the development and prognosis of breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； Angiopoietin-2； Tie-2； Prognosis

First-authors address：Huaihe Hospita1 of Henan University，Kaifeng 475000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.006

乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但有研究表明乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展與血管生成關(guān)系密切，乳腺癌組織中的微血管密度明顯高于正常乳腺組織[1]。血管生成素-2（Angiopoietin-2）主要通過與內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體-2（Tie-2）的結(jié)合介導(dǎo)血管生成[2]。血管生成不僅為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，而且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究主要通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Angiopoietin-2及其受體Tie-2在乳腺癌中的表達(dá)，探討兩者的表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003年1月-2011年12月在河南大學(xué)淮河醫(yī)院乳腺外科手術(shù)并經(jīng)組織病理學(xué)確診的女性乳腺癌患者121例，全部病例均未行術(shù)前放療和化療。年齡26～73歲，平均（53.9±7.8）歲。組織學(xué)分型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌76例，導(dǎo)管內(nèi)癌39例，浸潤(rùn)性小葉癌6例；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者75例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例，臨床分期Ⅰ期21例，Ⅱ期72例，Ⅲ期27例，Ⅳ期1例。同時(shí)選擇38例乳腺良性病變中的病變旁組織為正常乳腺組織，經(jīng)病理學(xué)觀察確定為正常乳腺組織。

1.2 方法 兔抗人Angiopoietin-2及Tie-2多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自博士德公司，一抗以1∶100稀釋使用。所有標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后石蠟包埋，4 μm的組織連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽微波高壓抗原修復(fù)，然后滴加一抗4 ℃過夜，室溫復(fù)溫后滴加二抗并于37 ℃溫箱孵育1 h，DAB顯色，然后蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水后封片。采用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤組織染色強(qiáng)度判定：未染色記作0分；輕度染色記作1分；中度染色記作2分；強(qiáng)度染色記作3分。腫瘤組織染色細(xì)胞百分比：在高倍鏡下選取陽(yáng)性最多的區(qū)域，記錄5個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，計(jì)算其平均值。每個(gè)視野染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)平均值分為4個(gè)級(jí)別：0～25%記作0分；25%～50%記作1分；50%～75%記作2分；>75%記作3分。組織染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分比級(jí)別之和3～6分為陽(yáng)性。以上檢測(cè)有病理科醫(yī)生采用盲法獨(dú)立檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌中的表達(dá)情況 Angiopoietin-2和Tie-2的陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞漿/細(xì)胞膜基質(zhì)，為淡黃色到棕黃色顆粒細(xì)胞漿，在乳腺癌中絕大多數(shù)導(dǎo)管上皮細(xì)胞顯示強(qiáng)陽(yáng)性，基質(zhì)組織不染色；而在正常乳腺組織中細(xì)胞不染色或染色細(xì)胞數(shù)目減少，見圖1。在121例乳腺癌患者中，Angiopoietin-2的陽(yáng)性表達(dá)率為80.99%（98/121），Angiopoietin-2在正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為10.53%（4/38）。Tie-2在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為75.21%（91/121），在正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為15.79%（6/38）。研究結(jié)果顯示，兩者在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Angiopoietin-2和Tie-2的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)ngiopoietin-2和Tie-2的表達(dá)與患者的年齡、分化程度及腫瘤大小均無(wú)關(guān)（P<0.05），但是與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期相關(guān)（P<0.05）。Angiopoietin-2和Tie-2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.33%（64/75）和82.67%（62/75），均高于其在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的52.17%（24/46）和45.65%（21/46），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ang-2、Tie-2在Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.71%（24/28）和78.57%（22/28），均高于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌的52.69%（49/93）和50.54%（47/93），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Angiopoietin-2和Tie-2的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-rank test）分析Angiopoietin-2和Tie-2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Angiopoietin-2陰性的乳腺癌患者生存期顯著高于Angiopoietin-2陽(yáng)性的患者（P=0.026），見圖2；且Tie-2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后較Tie-2陰性患者差，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），見圖3。

3 討論

Angiopoietin-2為分泌型糖蛋白，主要通過與內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸酶受體Tie-2結(jié)合而發(fā)揮功能。當(dāng)Angiopoietin-2與內(nèi)皮細(xì)胞上的Tie-2結(jié)合時(shí)，可引起內(nèi)皮細(xì)胞之間、內(nèi)皮細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的相互作用減弱，破壞血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，由此導(dǎo)致毛細(xì)血管形成新的血管[3-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)這兩種在功能上相關(guān)的蛋白在肺癌等多種腫瘤中的表達(dá)上調(diào)并在腫瘤血管形成中起著重要作用[5-6]，但是兩者在乳腺癌組織中表達(dá)尚不明確，特別是其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系并不清楚。本研究對(duì)Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌中的表達(dá)及預(yù)后進(jìn)行了初步探討。

本研究首先觀察Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示乳腺癌中Angiopoietin-2和Tie-2的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常乳腺組織（P<0.05），表明兩者可能以協(xié)同或互補(bǔ)的方式共同參與乳腺癌的發(fā)生過程。目前研究表明，Angiopoietin-2與Tie-2相互作用而參與腫瘤血管的重塑及組織修復(fù)的過程，其在腫瘤組織的高表達(dá)可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等[7]。有學(xué)者通過動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)Angiopoietin-2轉(zhuǎn)染促進(jìn)肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在肺轉(zhuǎn)移灶中Angiopoietin-2呈過表達(dá)并破壞內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，而阻斷Angiopoietin-2后可減少淋巴結(jié)、肺轉(zhuǎn)移和腫瘤淋巴管生成[8]。Imanishi等[9]研究表明Angiopoietin-2和Tie-2上調(diào)不但促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移并且在轉(zhuǎn)移發(fā)生的啟動(dòng)階段起關(guān)鍵作用。而本研究結(jié)果顯示，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中Angiopoietin-2和Tie-2的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05），并且兩者與乳腺癌的分期相關(guān)，提示兩者在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程中可能起重要作用，可以作為判斷乳腺癌惡性程度的指標(biāo)，本研究結(jié)果與在腎癌、結(jié)腸癌及卵巢癌中的研究一致[10-12]。

有研究發(fā)現(xiàn)靶向抑制Ang-2/Tie-2可減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤的生長(zhǎng)，Ang-2 是未來(lái)的治療腫瘤的靶點(diǎn)[13-14]。Han等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Angiopoietin-2的高標(biāo)表達(dá)與患者的生存期降低有關(guān)。本研究進(jìn)一步對(duì)Angiopoietin-2和Tie-2與乳腺癌生存期的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明對(duì)Angiopoietin-2陽(yáng)性的乳腺癌患者生存期顯著高于Angiopoietin-2陰性的乳腺癌患者（P<0.05），并且Tie-2陽(yáng)性的乳腺癌患者生存期顯著高于Tie-2陰性的乳腺癌患者（P<0.05），這一結(jié)果支持這兩種因子是預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，兩者可以作為預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2016-09-18） （本文編輯：程旭然）