李龍梅 泮紅飛 張 紅 羅軍敏 馮繼紅

(遵義醫(yī)學院免疫學教研室，貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，遵義563003)

miR-581對結(jié)直腸癌SW620細胞增殖能力的影響①

李龍梅 泮紅飛 張 紅 羅軍敏 馮繼紅②

(遵義醫(yī)學院免疫學教研室，貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，遵義563003)

目的：探討miR-581對結(jié)直腸癌SW620細胞增殖能力的影響。方法：分別用攜帶miR-581基因的慢病毒顆粒(LV-miR-581-GFP)和miR-581 mimics(miR-581)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞株SW620作為實驗組；用對照組病毒顆粒(LV-GFP)和對照組mimics (Vector)轉(zhuǎn)染SW620細胞株作為陰性對照組。用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各組細胞中miR-581的mRNA表達水平；CCK8和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力和克隆形成能力的變化。結(jié)果：實驗組SW620細胞中miR-581表達較對照組明顯增高(P<0.05)；CCK8和克隆形成實驗顯示過表達實驗組細胞的增殖及克隆形成能力較對照組明顯增強(P<0.05)。 結(jié)論：miR-581對結(jié)直腸癌SW620 細胞的增殖具有促進作用。

miR-581；結(jié)直腸癌；增殖

結(jié)直腸癌是世界上常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，2015年癌癥統(tǒng)計報道，其每年新發(fā)病例130多萬，死亡率49萬多，嚴重威脅人類的健康[1]。盡管近年來結(jié)直腸癌治療水平不斷提高，但結(jié)直腸癌患者死亡率仍不斷上升[2]。結(jié)直腸癌發(fā)病是一個多因素，多步驟的過程。因此，在分子水平揭示結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制，尋找新的靶分子治療和干預(yù)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

miRNAs是一類長度約22～24個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因的3′端結(jié)合調(diào)控靶基因的表達[3，4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs在結(jié)直腸癌中異常表達，miRNAs作為促癌基因或抑癌基因參與細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。miR-130b可以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖，促進凋亡[6]；miR-21通過靶向MARCKS對前列腺癌的增殖、侵襲和凋亡發(fā)生作用[7]。miR-581是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-581在肝癌組織中低表達，且對肝癌細胞的生長具有促進作用[8]。在我們前期研究中，通過基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)miR-581與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。因此，本研究初步探討miR-581對結(jié)直腸癌SW620細胞增殖及生長的影響，為進一步探討miR-581在結(jié)直腸癌中所發(fā)揮的生物學功能作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 實驗所選用SW620細胞株購自上海生命科學研究院細胞庫；L-15培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；慢病毒誘導(dǎo)表達載體購自上海吉凱基因；miR-581 mimics購自北京歐格林生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；細胞增殖檢測CCK8試劑購自Sigam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細胞株SW620選用L-15培養(yǎng)基，培養(yǎng)液中含10%FBS和1% PEST。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，每2～3 d換液1次，當細胞數(shù)達長滿培養(yǎng)瓶底部時，收集細胞。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染實驗 將對數(shù)生長期的SW620細胞用胰酶消化，計數(shù)后均勻接種于6 孔板，分為2組：實驗組(LV-miR-581)、空載慢病毒對照組(LV-NC) 。待細胞完全貼壁、細胞匯合率達60% 左右后進行轉(zhuǎn)染，依次加入終濃度為8 μg/ml Polybrene、Eni.S、L-15 培養(yǎng)基及稀釋的標準濃度病毒液( MOI 為100) ，使其總體積達1 ml，轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 mimics轉(zhuǎn)染實驗 將對數(shù)生長期的SW620 細胞用胰酶消化，計數(shù)后均勻接種于6 孔板，分為2組：實驗組(miR-581)、對照組(Vector)。待細胞完全貼壁、待細胞匯合率達到75%進行轉(zhuǎn)染，用無血清培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectamine 2000(3 μl)、miR-581 mimics (5 μl)或?qū)φ战Mmimics(5 μl)。室溫孵育5 min，將mimics和Lipofecta mine 2000混合，混勻后，37℃孵箱孵育20 min，分別加入細胞中，培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 總RNA提取 用Trizol 法按說明書提取SW620細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測提取的總RNA 的純度，要求A260/A280比值為1.8～2.0。

1.2.5 cDNA 合成和qRT-PCR 取1 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，miR-581逆轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件按試劑盒說明書操作。qRT-PCR反應(yīng)體系及條件：Premix Ex Taq Version 2.0 10 μl，ddH2O 8 μl， cDNA 1 μl， 20×TaqMan Small RNA Assay 1 μl， 95℃預(yù)變性 5 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，45個循環(huán)。將擴增產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳，確定擴增產(chǎn)物目的片段大小。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.2.6 CCK8法檢測細胞增殖變化 參照CCK8試劑說明進行,分別取上述2組細胞以5×103孔-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板(100 μl/孔)，37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入10 μl CCK8繼續(xù)孵育2 h后，用酶標儀在450nm波長下檢測各孔的吸光度值。每隔24 h檢測一次，每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 克隆形成檢測克隆形成能力 分別取上述兩組細胞以500/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板(2 ml/孔)，37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)，2～3 d換液一次；15 d后PBS清洗細胞3次，10%甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗干凈，鏡下觀察計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-581慢病毒感染效果 慢病毒感染結(jié)腸癌SW620細胞后48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察感染效果，兩組細胞熒光感染率均達到80%左右，見圖1，qRT-PCR檢測感染后SW620細胞miR-581表達，實驗組(LV-miR-581)細胞miR-581的表達明顯高于對照組 (LV-NC)細胞，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 miR-581過表達對增殖的影響

2.2.1 CCK8實驗結(jié)果 培養(yǎng)2 d時，兩組細胞之間的增殖速度沒有明顯差異(P>0.05)，從第3天開始，實驗組(LV-miR-581)細胞增殖速度明顯高于對照組(LV-NC)細胞 (P<0.05)，見圖2，實驗結(jié)果表明，miR-581過表達可以增強SW620細胞的增殖能力。

2.2.2 克隆形成結(jié)果 實驗組(LV-miR-581)細胞克隆數(shù)明顯高于對照組(LV-NC)細胞(P<0.05)，見圖3，表明過表達miR-581可以增強SW620細胞的克隆形成能力。

圖1 慢病毒感染SW620細胞熒光表達情況及qPCR檢測感染后miR-581表達Fig.1 Lentivirus infection of SW620 cells and GFP expression and expression of miR-581 in SW620 cells were detected by qRT-PCRNote：*.P<0.05.

圖2 miR-581過表達對SW620增殖能力的影響Fig.2 Effects of miR-581 overexpression on proliferation of SW620 cellsNote：*.P<0.05.

圖3 過表達miR-581對SW620克隆形成能力的影響Fig.3 Effects of miR-581 overexpression on clone formation of SW620 cellsNote：**.P<0.01.

圖4 qRT-PCR檢測SW620細胞miR-581的表達Fig.4 Expression of miR-581 in SW620 cells were detected by qRT-PCRNote：*.P<0.05.

2.3 miR-581在結(jié)腸癌SW620細胞中轉(zhuǎn)染效率測定 以上結(jié)果可以看出miR-581可促進細胞的增殖能力，為了進一步驗證上述結(jié)果，用mimics轉(zhuǎn)染SW620細胞，轉(zhuǎn)染后48 h，qRT-PCR檢測兩組細胞miR-581的表達，實驗組(miR-581)細胞miR-581的表達明顯高于對照組(Vector)細胞(P<0.05)，見圖4。

圖5 過表達miR-581對SW620增殖能力的影響Fig.5 Effects of miR-581 overexpression on proliferation of SW620 cellsNote：*.P<0.05.

圖6 過表達miR-581對SW620增殖能力的影響Fig.6 Effects of miR-581 overexpression on clone formation of SW620 cellsNote：*.P<0.05.

2.4 miR-581過表達對增殖的影響

2.4.1 CCK8結(jié)果 同miR-581慢病毒感染后結(jié)果相同，培養(yǎng)2 d時，兩組細胞之間的增殖速度沒有明顯差異。從第3天開始，實驗組(miR-581)細胞的增殖能力高于對照組(Vector)細胞(P<0.05)，見圖5。進一步驗證了上述結(jié)果，過表達miR-581可以促進SW620細胞的增殖能力。

2.4.2 克隆形成實驗結(jié)果 與慢病毒結(jié)果相吻合，實驗組(miR-581)細胞克隆形成率較對照組(Vector)細胞明顯增高(P<0.05)，見圖6。說明過表達miR-581可以促進SW620細胞的克隆形成能力。

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)居世界第三位。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率也逐年增高，尋找新的靶基因是近年來腫瘤研究的熱點。miRNA通過與靶基因的3′端結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控基因表達，近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA既可作為促癌基因，也可作為抑癌基因，介導(dǎo)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等多個病理過程，miRNA在腫瘤中的作用越來越受到人們的重視。例如，miR-21在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，并分別通過靶向調(diào)控PDCD4、TIAM1、SPRY2、PTEN、TGFBR2、CDC25A等分子促進結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[9-13]；miR-224通過調(diào)節(jié)SMAD4促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[14]；miR-27通過作用于VEGFR發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用[15]；miR-126可下調(diào)乳腺癌中VEGF的表達而抑制其增殖和遷移能力[16]。

miRNA可調(diào)控多種基因，參與多條信號通路網(wǎng)的調(diào)控，在腫瘤的增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-581在肝癌組織中表達下調(diào)，將miR-581 轉(zhuǎn)染入人肝腫瘤細胞株HepG2.2.15 可顯著促進細胞增殖，并可通過靶向Dicer 和EDEM1 促進HBsAg 的表達，認為在肝癌發(fā)生過程中下調(diào)miR-581可降低HBsAg 表達從而抑制肝細胞癌進展[8,17]。而關(guān)于miR-581在結(jié)直腸癌進展中的作用沒有相關(guān)報道。本研究分別將miR-581的慢病毒載體和miR-581轉(zhuǎn)染入SW620細胞，經(jīng)qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)兩種方法均使SW620細胞高表達miR-581，并且發(fā)現(xiàn)兩種方法都顯示過表達miR-581組細胞增殖較對照組增強，克隆數(shù)目較對照組增多，促進細胞生長，表明miR-581可促進SW620細胞的增殖能力。

本研究初步證實了miR-581過表達對結(jié)直腸癌的增殖具有促進作用。然而， miRNA在腫瘤調(diào)控機制中復(fù)雜，且細胞的增殖也是由多種基因進行調(diào)控，所以，miR-581調(diào)控腫瘤增殖具體是通過哪個靶基因，其促進腫瘤生長的機制具體又是什么，這些問題都有待深入研究。在以后的研究中我們將繼續(xù)對其促增殖的具體機制及在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用進行研究，全面了解miR-581在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學作用，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2016-07-25 修回2016-09-21]

(編輯 許四平)

Effects of miR-581 overexpression on proliferation of human colorectal cancer SW620 cells

LILong-Mei，PANHong-Fei,ZHANGHong,LUOJun-Min,FENGJi-Hong.

DepartmentofImmunology,ZunyiMedicalCollege,BaseforGraduateEducationinGuizhouProvince,Zunyi563003,China

Objective:To investigate the role of miR-581 overexpression on the proliferation of human colorectal cancer cell line SW620.Methods: The expression group,colorectal cancer SW620 cells were transfected with recombinant lentivirus vector (LV-miR-581) and miR-581 mimics(miR-581),the negative control group were transfected with negative control lentiviral vector (LV-GFP) and negative control mimics (vector).The mRNA expression of miR-581 was identified by qRT-PCR.Proliferation of the cells were detected by CCK8 assary and colony forming assary.Results: The expression of miR-581 at mRNA significantly increased in LV-miR-581 group compared with control groups were detected by qRT-PCR (P<0.05).Up-regulation of miR-581 markedly enhanced human colorectal cancer SW620 cells proliferation than those in the cells transfected with control vector (P<0.05).Conclusion: Forced expression of miR-581 accelerates the proliferation of colorectal cancer SW620 cells.

miR-581;Colorectal cancer;Proliferation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.018

①本文受國家自然科學基金項目(81560407)資助。

李龍梅(1987年-)，女，在讀碩士，主要從事臨床免疫的研究。

及指導(dǎo)教師：馮繼紅(1977年-)，男，博士，副教授，主要從事結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤干細胞調(diào)控機制研究，E-mail：jh_f@163.com。

R735.3

A

1000-484X(2017)02-0252-04

②遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤科，遵義563003。