柴琪瑤 劉翠華

(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101)

·專家述評(píng)·

泛素系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌與宿主相互作用中的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展①

柴琪瑤 劉翠華

(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是一種極其成功的胞內(nèi)病原菌，可通過多種策略實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，從而在宿主巨噬細(xì)胞中長(zhǎng)期存活。在對(duì)抗病原菌的防御過程中，泛素系統(tǒng)(Ubiquitin system)在激活宿主炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞自噬、吞噬體成熟和細(xì)胞死亡等天然免疫功能及相關(guān)信號(hào)通路中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。而另一方面，近年的研究表明Mtb等胞內(nèi)病原菌可通過分泌效應(yīng)蛋白(Effector proteins)挾持并利用宿主泛素系統(tǒng)進(jìn)而抑制宿主的免疫功能，這些病原-宿主互作的界面有望成為抗結(jié)核藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。

泛素系統(tǒng)；結(jié)核分枝桿菌；巨噬細(xì)胞；天然免疫；信號(hào)通路；效應(yīng)蛋白

柴琪瑤(1992年-)，2014年本科畢業(yè)于浙江大學(xué)植物保護(hù)專業(yè)，同年推薦免試進(jìn)入中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病原生物學(xué)專業(yè)，師從劉翠華教授碩博連讀。主要從事結(jié)核分枝桿菌和巨噬細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制研究。

劉翠華(1976年-)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所研究員，課題組長(zhǎng)，博士生導(dǎo)師。任“中國(guó)防癆協(xié)會(huì)結(jié)核病基礎(chǔ)專業(yè)分會(huì)”和“中國(guó)免疫學(xué)會(huì)青年工作委員會(huì)”等委員以及Scientific Reports等國(guó)際期刊編委。主要從事病原菌感染和宿主免疫防御的分子機(jī)制等方面的研究，在結(jié)核分枝桿菌逃逸宿主固有免疫機(jī)制等方面的研究中取得了一系列成果，在Cell、Nat Immunol、PNAS、J Immunol等期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文40余篇，作為編委或編者參編《泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解》等專著6部。

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是全球十大“致死性疾病”之一。世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，僅2015年全球就有1 040萬新增結(jié)核病例和140萬死亡病例；我國(guó)的結(jié)核患者數(shù)量(約91.8萬人)居世界第三位，同時(shí)也是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)病例最多的國(guó)家之一[1,2]。由于特殊的潛伏特性以及耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)和泛濫，結(jié)核病的防治工作面臨巨大的挑戰(zhàn)。深入研究Mtb與宿主的相互作用機(jī)制、為結(jié)核病的快速診斷和新藥研發(fā)提供新靶點(diǎn)迫在眉睫。

泛素(Ubiquitin，Ub)是真核生物中的一種由76個(gè)氨基酸組成的小分子量蛋白，能夠通過共價(jià)結(jié)合的方式連接到底物蛋白分子的賴氨酸殘基上而介導(dǎo)靶蛋白的降解[3]。自上世紀(jì)70年代被鑒定以來，人們發(fā)現(xiàn)泛素不僅是蛋白質(zhì)降解的信使，而且在細(xì)胞增殖和死亡、囊泡運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)及感染免疫等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。本文所討論的泛素系統(tǒng)包括泛素、泛素化(Ubiqu-itination)或去泛素化(Deubiquitination)修飾相關(guān)的酶、泛素結(jié)合蛋白或受體等，以及上述蛋白參與的各類泛素修飾過程。這些元素構(gòu)成的泛素系統(tǒng)在機(jī)體天然免疫系統(tǒng)抵御病原菌感染的過程中起到了多種調(diào)節(jié)作用。Mtb作為一種典型的胞內(nèi)菌在與宿主長(zhǎng)期共存的過程中進(jìn)化出多種免疫逃逸策略，本文將對(duì)泛素系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌與宿主互作過程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行論述，以期為結(jié)核感染及致病的分子機(jī)制研究提供新的思路。

1 結(jié)核分枝桿菌與宿主相互作用的分子機(jī)制

Mtb是一種強(qiáng)傳染性的胞內(nèi)病原菌，活動(dòng)性結(jié)核病患者咳出的氣溶膠只要攜帶1～3個(gè)活性菌體便可通過呼吸系統(tǒng)感染一個(gè)新的健康個(gè)體[5]。一般情況下，侵入肺部的非致病分枝桿菌，如恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)等將被肺泡巨噬細(xì)胞(Alveolar macrophage)識(shí)別和吞噬，最終被溶酶體的各類水解酶、活性氮/氧等物質(zhì)殺滅。然而，致病性的Mtb卻能避免被宿主完全清除。在肺表面感染Mtb的巨噬細(xì)胞將攜帶菌體穿過上皮細(xì)胞深入感染肺組織，并不斷地產(chǎn)生分化和聚集。隨后，淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)和樹突狀細(xì)胞(DC)等多種免疫細(xì)胞也會(huì)集結(jié)到周圍，最終在受感染的組織處發(fā)展成肉芽腫(Granuloma)[5]。一些學(xué)者認(rèn)為，宿主細(xì)胞形成穩(wěn)固的肉芽腫可在一定程度上限制病原菌的感染和擴(kuò)散，迫使其進(jìn)入休止(Quiescence)狀態(tài)[5,6]。然而，也有研究表明在感染初期Mtb會(huì)主動(dòng)促進(jìn)肉芽腫的形成，并利用這種特殊結(jié)構(gòu)來侵入新的細(xì)胞和組織，幫助其定殖和擴(kuò)散[5,7]。雖然諸多生物學(xué)特性尚未被揭示，但研究者發(fā)現(xiàn)只要機(jī)體的免疫功能穩(wěn)健，肉芽腫對(duì)宿主的健康并不顯示負(fù)面影響；只有當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生衰退或缺陷時(shí)，Mtb才會(huì)結(jié)束漫漫“長(zhǎng)征”而伺機(jī)活化和大量增殖[7]。換言之，肉芽腫實(shí)際上是Mtb與宿主免疫系統(tǒng)之間長(zhǎng)期博弈最終達(dá)到制衡狀態(tài)的產(chǎn)物，而Mtb與巨噬細(xì)胞的相互作用成為了這場(chǎng)戰(zhàn)役中最核心的部分。

進(jìn)入宿主體內(nèi)后，Mtb的細(xì)胞壁成分如磷脂酰肌醇甘露糖(PIM)、脂質(zhì)阿拉伯甘露聚糖(LAM)及其他一些外膜分子將被巨噬細(xì)胞通過膜表面受體所識(shí)別，這些受體有甘露糖受體(MR)、Toll-樣受體(TLR)、補(bǔ)體受體(CR)、凝集素受體(DC-SIGN)和免疫球蛋白Fc段受體(Fc receptor)等，并進(jìn)一步激活下游效應(yīng)分子而引發(fā)宿主免疫防御。以TLR為例，Mtb細(xì)胞壁的脂蛋白(Lipoprotein)、脂多糖(Liposaccharide)及CpG DNA可以作為TLR2的配體被識(shí)別而激活下游的NF-κB信號(hào)通路，并刺激TNF-α的分泌進(jìn)而活化巨噬細(xì)胞，同時(shí)激發(fā)維生素D受體及維生素D-1-羥化酶基因的表達(dá)誘導(dǎo)抗菌肽(Cathelicidin)的釋放[8]。被吞噬入胞后，Mtb仍將面臨多方面的免疫清除作用。Mtb除了通過內(nèi)吞/吞噬體途徑(Endocytic/phagocytic pathway)被降解外，逃離吞噬體的病原菌還會(huì)觸發(fā)細(xì)胞自噬(Autophagy)而被重新捕獲和清除。例如，NOD是一類重要的天然免疫胞內(nèi)識(shí)別受體，Mtb的胞壁酰二肽(MDP)受到NOD2的識(shí)別后，將激發(fā)宿主炎癥因子及氮氧化物(NO)的釋放來起到殺菌作用，同時(shí)活化的NOD2將誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[9]。

然而，作為最古老的傳染病之一的Mtb在與宿主長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中采取了一系列特殊的免疫逃逸和調(diào)控策略來達(dá)到對(duì)宿主的生境適應(yīng)(Local adaptation)目的[10]。Mtb有別于其他細(xì)菌的一個(gè)重要特征是具有復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)——由類似革蘭氏陰性菌內(nèi)膜的質(zhì)膜(Plasma membrane)、富含糖蛋白的周質(zhì)區(qū)(Periplasmic space)以及高度疏水的外膜(Outer membrane)構(gòu)成，這讓體內(nèi)微生境(Niche)中的Mtb能夠有效地隔離有害物質(zhì)，并使其擁有一套獨(dú)特的分泌系統(tǒng)[11]。Mtb具有GSP/SecA1、Tat、SecA2及ESAT6四類分泌系統(tǒng)，其中，ESAT6分泌系統(tǒng)又稱Ⅶ型分泌系統(tǒng)(T7SS)或Esx分泌系統(tǒng)，能夠分泌多種效應(yīng)蛋白(Effector proteins)，成為抵抗宿主免疫系統(tǒng)的利器[11,12]。Mtb能夠編碼ESX-1～5五種ESAT6分泌系統(tǒng)，以ESX-1為例，該系統(tǒng)由EccB/C/D/E四個(gè)膜組分構(gòu)成跨越細(xì)菌質(zhì)膜的分泌孔道，其中EccC的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別EccA并與之形成AAA+ATPase，而EspG扮演分子伴侶(Chaperone)的角色與底物蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的異二聚體，在胞質(zhì)中EccA/G兩個(gè)輔助因子的幫助下指導(dǎo)底物蛋白結(jié)合到分泌通道復(fù)合物上；此外，Mtb的膜蛋白酶MycP還能進(jìn)一步對(duì)ESX-1分泌蛋白進(jìn)行加工，成熟的效應(yīng)蛋白隨后被遞送到菌表面或宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多樣化的免疫調(diào)控作用[12]。目前，對(duì)于T7SS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機(jī)制還所知甚少，ESX系統(tǒng)和分泌底物之間、效應(yīng)蛋白和細(xì)菌毒力之間的微妙聯(lián)系等都是Mtb致病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。

2 泛素系統(tǒng)調(diào)控宿主天然免疫信號(hào)通路的機(jī)制

2.1 泛素修飾的分子機(jī)制 經(jīng)典的泛素化過程一般需要三種泛素化酶的參與，即通過泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素偶聯(lián)酶(Ubiquitin-conjugating enzyme，E2)和泛素連接酶(Ubiquitin-ligase enzyme，E3)的協(xié)助來活化泛素分子并將其轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，形成多聚泛素化(Polyubiquitination)或單泛素化(Monoubiquitionation)修飾[3]。多聚泛素化修飾按泛素之間所連接的賴氨酸位點(diǎn)的不同可以分為K6、K11、K27、K29、K33、K48及K63泛素鏈；泛素也能夠被一類特殊的E3，即線性泛素鏈組裝復(fù)合物L(fēng)UBAC通過N端甲硫氨酸與另一泛素分子的羧基相連，形成線性泛素化(Linear ubiquitination)[13]。然而，最近發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)分泌的一類SidE家族效應(yīng)蛋白SdeA具有單-ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶模序(Mono-ADP-ribosyltransferase motif)，能夠通過ADP-核糖基化來活化泛素分子，在無需E1、E2的參與下直接泛素化宿主的多種Rab GTPase，被稱為一體化泛素連接酶(All-in-one E3)[14]。此外，蛋白質(zhì)的泛素化修飾實(shí)際上也是一個(gè)可逆的過程，與泛素化酶功能相反，真核生物和一些原核生物能夠編碼一些去泛素化酶(DUBs)來水解并破壞底物蛋白與泛素之間或多聚泛素鏈內(nèi)的硫酯鍵[13]。

泛素除了可以通過共價(jià)結(jié)合的方式連接到靶蛋白上以外，某些蛋白可直接通過非共價(jià)作用結(jié)合上單個(gè)泛素或泛素鏈。這類泛素結(jié)合蛋白往往存在一個(gè)或多個(gè)泛素結(jié)合域(UBD)，雖然這些UBD在三級(jí)結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出多樣性，如α-螺旋結(jié)構(gòu)的泛素互作模序(UIM)、鋅指(ZnF)結(jié)構(gòu)、pleckstrin同源(PH)折疊結(jié)構(gòu)和泛素偶聯(lián)酶變體(UEV)等，大部分UBD都是通過識(shí)別并結(jié)合泛素分子由Leu8、Ile44、His68及Val70組成的疏水氨基酸簇而產(chǎn)生相互作用[15]。綜上所述，泛素系統(tǒng)復(fù)雜多變的蛋白修飾和互作方式奠定了其在天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行精確調(diào)控的分子基礎(chǔ)。

2.2 泛素系統(tǒng)對(duì)炎癥免疫信號(hào)通路的調(diào)控 模式識(shí)別受體(PRR)是一類能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(DAMP)的重要免疫受體，包括上述的TLR、NOD樣受體(NLR)及RIG-Ⅰ樣受體(RLR)等。PRR感應(yīng)到病原菌入侵后，將通過信號(hào)級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)刺激促炎細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的釋放，并刺激NF-κB和MAPK等炎癥相關(guān)信號(hào)通路的活化。例如，巨噬細(xì)胞膜表面受體TLR4以病原菌表面的脂多糖(LPS)作為配體，在接頭蛋白TIRAP的幫助下集聚轉(zhuǎn)接分子MYD88，后者通過結(jié)合IRAK4和IRAK1兩類激酶來招募TNF受體相關(guān)因子TRAF3/6及凋亡抑制因子cIAP1/2，最終在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)形成信號(hào)級(jí)聯(lián)復(fù)合物[16]。其中，具有E3連接酶功能的TRAF6在Ubc13-Uev1a組成的E2復(fù)合物的作用下連接K63泛素鏈而活化，并同時(shí)泛素化IRAK1和cIAP1/2[17]。這些K63泛素鏈在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起到了腳手架的作用，能夠通過結(jié)合底物分子(如TAB2/3和NEMO)來進(jìn)一步募集和激活TAK1和IKK兩類激酶復(fù)合物；此外，LUBAC介導(dǎo)的NEMO在Lys285與Lys309位點(diǎn)的線性泛素化對(duì)NF-κB通路中的信號(hào)傳遞也具有重要意義[18]。TAK1活化后，能夠通過激活MAPK激酶MKK4/6/7來刺激JNK及p38信號(hào)通路，同時(shí)磷酸化激活I(lǐng)KK；而活化的IKK能夠磷酸化IκBα并介導(dǎo)其被SCFβTrCP E3連接酶K48泛素化降解，從而解除對(duì)NF-κB的抑制，使后者入核調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)[19]。

近年來，炎癥小體(Inflammasome)信號(hào)通路在調(diào)節(jié)炎癥免疫方面的功能愈來愈受到研究者的重視。炎癥小體復(fù)合物由受體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC以及前體caspase-1(pro-caspase-1)所組成。NLR家族如NLRP3、NLRP1、NLRC4及胞質(zhì)中的DNA感受器AIM2是目前已發(fā)現(xiàn)的幾類炎癥小體受體，感應(yīng)刺激后，將通過激活caspase-1介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)[20]。與凋亡(Apoptosis)不同的是，細(xì)胞焦亡是炎性caspase(caspase-1和/或caspase-11)活化后發(fā)生的炎癥性細(xì)胞死亡方式，將導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂出現(xiàn)孔隙，引起細(xì)胞溶脹裂解，從而破壞胞內(nèi)寄生菌定殖的微生境，使其出胞后被其他免疫細(xì)胞所吞噬和殺滅。目前，泛素系統(tǒng)對(duì)于NLRP3炎癥小體的調(diào)控機(jī)制較為清楚。巨噬細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)，胞內(nèi)的 E3連接酶SCF的FBXL2催化亞基能夠通過K48泛素化修飾NLRP3而介導(dǎo)其降解；當(dāng)受到病原菌配體LPS刺激時(shí)，細(xì)胞將誘導(dǎo)提高E3連接酶FBXO3的表達(dá)，后者通過泛素化降解FBXL2來維持NLRP3的蛋白水平，起到炎癥上調(diào)作用[21]。其次，胞質(zhì)中一類K63去泛素化酶BRCC3能夠通過直接去泛素化穩(wěn)定NLRP3的蛋白水平[21]。另一方面，泛素系統(tǒng)對(duì)炎癥小體信號(hào)通路存在有效的負(fù)調(diào)控機(jī)制，從而避免過度活化的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。例如，巨噬細(xì)胞內(nèi)的去泛素化酶A20可抑制炎癥小體復(fù)合物中caspase-1對(duì)前體IL-1β(pro-IL-1β)的切割活性，同時(shí)能夠去除pro-IL-1β的K63泛素化而起到負(fù)調(diào)節(jié)作用[22]。另一項(xiàng)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(Dopamine)的研究發(fā)現(xiàn)，其能夠通過活化細(xì)胞內(nèi)E3連接酶MARCH7來泛素化降解NLRP3而起到抑炎作用[23]。此外，巨噬細(xì)胞中存在一類Cullin環(huán)E3連接酶抑制子GLMN，對(duì)NLRP3和NLRC4兩類炎癥小體的活化具有抑制功能；然而，這個(gè)特性也被腸上皮細(xì)胞寄生菌志賀氏桿菌(Shigella)所利用，其分泌的具有E3連接酶功能的IpaH7.8效應(yīng)蛋白能夠通過泛素化介導(dǎo)GLMN的降解，進(jìn)而解除后者對(duì)炎癥因子的活化抑制[24]。

2.3 泛素系統(tǒng)對(duì)自噬信號(hào)通路的調(diào)控 自噬發(fā)生時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生一種稱為自噬體(Autophagosome)的雙層膜泡結(jié)構(gòu)，能夠在自噬相關(guān)信號(hào)調(diào)控下逐漸與溶酶體相融合并降解所包裹的內(nèi)容物。自噬調(diào)控核心由一類自噬相關(guān)蛋白(Atg)所組成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，自噬體的形成主要受到了ULK(酵母Atg1同源)蛋白激酶復(fù)合體及VPS34脂激酶復(fù)合體的調(diào)控。ULK復(fù)合體由ULK1/2、FIP200(酵母Atg17同源)、ATG13及ATG101等組成，并受到對(duì)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)條件敏感的mTORC1激酶復(fù)合體的直接調(diào)控[25]。此外，胞質(zhì)中mTOR激酶的另一種復(fù)合體形式mTORC2能夠磷酸化Akt激酶，通過活化PI3K-Akt-mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)促進(jìn)mTORC1對(duì)自噬的抑制活性，并且該通路中Akt與mTOR的激酶活性還受到了TRAF6介導(dǎo)的K63泛素化的正向調(diào)節(jié)[26]。脂激酶VPS34通過與p150及Beclin-1形成激酶復(fù)合物磷酸化磷脂酰肌醇形成PI3P，PI3P在胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)與胞質(zhì)交界處聚集，為募集自噬體發(fā)生相關(guān)蛋白提供錨定點(diǎn)，同時(shí)能夠介導(dǎo)多種效應(yīng)分子有秩序地調(diào)控自噬體的轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟[27]。Beclin-1作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)接分子能夠結(jié)合多種調(diào)控蛋白來增強(qiáng)(如UVRAG、ATG14L、Bif-1及AMBRA1等)或抑制(如Bcl-2、TAB2/3及Rubicon等)VPS34的激酶活性，從而起到調(diào)節(jié)自噬的功能[28]。ULK及VPS34復(fù)合體中的多個(gè)組分都受到了泛素調(diào)控。例如，自噬發(fā)生時(shí)胞質(zhì)中的AMBRA1能夠募集TRAF6并與ULK1或Beclin-1結(jié)合使其K63泛素化，一方面能夠穩(wěn)定及活化ULK復(fù)合體，另一方面通過引起B(yǎng)eclin-1寡聚化并阻礙其與Bcl-2結(jié)合而起到對(duì)VPS34的正調(diào)控；相反地，mTORC1則能夠通過磷酸化AMBRA1來阻礙其招募TRAF6而起到自噬抑制作用[29]。此外，Beclin-1還受到E3連接酶RNF216的K48泛素化修飾，從而減弱其與VPS34復(fù)合物的結(jié)合；相反地，去泛素化酶USP19則能夠特異性降解Beclin-1的K11泛素鏈從而維持其穩(wěn)定性[29]。

近年來，異體自噬(Xenophagy)和線粒體自噬(Mitophagy)這兩類選擇性自噬機(jī)制受到了格外關(guān)注。線粒體自噬過程中，PINK1激酶能夠在去極化的線粒體外膜聚集，通過磷酸化被泛素化修飾的線粒體蛋白上的泛素分子來招募選擇性自噬受體，如OPTN、NDP52等[30]。這些受體由泛素結(jié)合域UBA與泛素化蛋白結(jié)合，同時(shí)通過LIR(LC3 interacting region)模序結(jié)合LC3，從而和底物蛋白一起經(jīng)自噬體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中發(fā)生降解。同時(shí)，PINK1也能在線粒體外膜上募集E3連接酶Parkin，后者泛素化多類線粒體蛋白底物(如VDAC、Miro及mitofusin-2等)并介導(dǎo)降解[30]。有趣的是，Parkin也能夠介導(dǎo)胞內(nèi)病原菌的異體自噬。例如，Mtb能通過ESX-1系統(tǒng)在吞噬體上造成孔洞從而釋放細(xì)菌DNA激活cGAS-STING依賴的胞質(zhì)DNA感應(yīng)信號(hào)通路，進(jìn)而誘發(fā)Parkin聚集到Mtb吞噬體上并對(duì)其標(biāo)記上K63泛素化修飾引起自噬降解[31]。然而，Parkin針對(duì)病原菌或吞噬體膜上的泛素化底物，以及其在菌表面募集和活化的機(jī)制目前尚不清楚。除了OPTN及NDP52外，還發(fā)現(xiàn)有SQSTM1(p62)和NBR1等多種選擇性自噬受體，這些受體在介導(dǎo)選擇性自噬時(shí)可能并非功能冗余。例如，p62更傾向于介導(dǎo)K63而非K48泛素化標(biāo)記的底物降解，OPTN則傾向于結(jié)合線性泛素鏈；p62能夠與NBR1形成異二聚體協(xié)作完成對(duì)泛素化底物的自噬介導(dǎo)，同時(shí)NBR1也能自身形成低聚化介導(dǎo)過氧化物酶體自噬(Pexophagy)；然而p62在介導(dǎo)一些胞內(nèi)菌如志賀菌、李斯特菌(Listeria)及沙門氏菌(Salmonella)的自噬清除時(shí)僅需要NDP52而非NBR1的協(xié)助[32]。

2.4 泛素系統(tǒng)對(duì)吞噬體成熟信號(hào)通路的調(diào)控 宿主的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等專職吞噬細(xì)胞對(duì)病原菌具有很強(qiáng)的吞噬清除作用。吞噬發(fā)生時(shí)，首先由Fcγ受體(FcγR)、補(bǔ)體受體3(CR3)等膜表面受體接受病原菌攜帶的吞噬信號(hào)而引起胞內(nèi)側(cè)的免疫受體模序ITAM的活化，并進(jìn)一步誘發(fā)一系列吞噬相關(guān)激酶(如Syk、Cdc42、Rac1/2及PI3K等)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白重組和質(zhì)膜內(nèi)化形成吞噬體(Phagosome)[33]。隨后，吞噬體經(jīng)歷早期和晚期階段逐漸酸化和成熟，最終與溶酶體融合形成吞噬溶酶體(Phagolysosome)介導(dǎo)菌的降解。

目前發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在超過60個(gè)成員的Rab家族GTPase，它們是指導(dǎo)吞噬體成熟過程的核心機(jī)制。例如，Rab5對(duì)介導(dǎo)質(zhì)膜處發(fā)生的初期吞噬體與早期內(nèi)體(Endosome)的融合具有推進(jìn)作用。一方面，鳥苷酸交換因子(GEF)Rabex-5在早期吞噬體膜上的募集能夠促進(jìn)Rab5的活化；另一方面活化的Rab5則可通過招募效應(yīng)分子Rabaptin-5進(jìn)一步促進(jìn)Rabex-5的活性，從而形成一個(gè)正反饋循環(huán)[34]。在這個(gè)循環(huán)中，泛素調(diào)控起到了關(guān)鍵作用。Rabex-5是一類具有E3連接酶活性的泛素結(jié)合蛋白，能夠通過ZnF及一個(gè)反泛素結(jié)合模序(IUIM)從胞質(zhì)中結(jié)合到泛素化的吞噬體膜蛋白上行使對(duì)Rab5的激活功能；當(dāng)內(nèi)體融合完成后， Rabex-5將被單泛素化修飾并轉(zhuǎn)位回到胞質(zhì)中[34]。此外，內(nèi)體相關(guān)的一類DUBs，如AMSH和UBPY則可通過去泛素化Rabex-5來恢復(fù)該循環(huán)[35]。伴隨早期吞噬體發(fā)展為晚期吞噬體的一個(gè)重要標(biāo)識(shí)是Rab5向Rab7的轉(zhuǎn)變。Rab7通過募集諸多效應(yīng)分子來協(xié)助吞噬體的進(jìn)一步成熟，并介導(dǎo)晚期吞噬體與溶酶體的融合。研究發(fā)現(xiàn)，Rab7是E3連接酶Parkin的一個(gè)底物，被泛素化修飾后的Rab7能夠增強(qiáng)其在膜上的穩(wěn)定性及招募效應(yīng)分子的能力，從而促進(jìn)吞噬體成熟[36]。

在胞質(zhì)中，有一類具有封閉膜結(jié)構(gòu)并包裹大量腔內(nèi)小泡的多泡小體(MVB)也受到了吞噬體的識(shí)別和降解，并影響吞噬體的發(fā)展和病原菌的清除能力。例如，由ESCRT-0/Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組成的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)內(nèi)體分選復(fù)合物(ESCRT)是指導(dǎo)MVB形成的主要分子機(jī)制，而Mtb的Esx-3效應(yīng)蛋白EsxH和EsxG能夠形成復(fù)合物靶向破壞ESCRT的功能，從而抑制吞噬體的成熟[37]。實(shí)驗(yàn)表明，泛素系統(tǒng)在調(diào)控ESCRT復(fù)合物介導(dǎo)的MVB生物合成過程具有重要作用。ESCRT-0/Ⅰ/Ⅱ復(fù)合物能夠通過募集多種含不同類型UBD的泛素結(jié)合蛋白，如STAM1/2(UIM)、Hrs(UIM)、Tsg101(Uev)及EAP45(GLUE)等捕獲和聚集泛素化貨物于分隔小泡中，隨后ESCRT-Ⅲ啟動(dòng)膜泡出芽和分裂，促使包被貨物小泡的MVB形成[38]。

2.5 泛素系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞死亡信號(hào)通路的調(diào)控 如前所述，泛素系統(tǒng)能夠通過炎癥及自噬信號(hào)通路來影響細(xì)胞焦亡和自噬性細(xì)胞死亡；而凋亡和壞死(Necrosis)作為天然免疫信號(hào)通路中一類重要機(jī)制同樣受到了泛素系統(tǒng)的精密調(diào)控。細(xì)胞凋亡根據(jù)誘發(fā)的起始因素的不同可分為外源性凋亡途徑(Extrinsic pathway)和內(nèi)源性凋亡途徑(Intrinsic pathway)。外源途徑誘導(dǎo)凋亡時(shí)，最先通過細(xì)胞表面一類接受凋亡信號(hào)(如TNF-α、FasL及TRAIL等)的死亡受體(DR)，如TNFR1、DR3、DR4、DR5及Fas等介導(dǎo)激活。例如，TNF-α與TNFR1形成復(fù)合體激活后可以通過受體結(jié)合激酶RIPK1依賴或非依賴的兩種途徑傳遞凋亡信號(hào)，且都受到了泛素系統(tǒng)的調(diào)控。其中，RIPK1依賴的凋亡信號(hào)通路被認(rèn)為可能發(fā)生在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑的下游。因?yàn)楫?dāng)接受凋亡信號(hào)后，線粒體外膜通透性改變而促使一類凋亡相關(guān)蛋白Smac被釋放到胞質(zhì)中，隨后與凋亡抑制蛋白cIAP結(jié)合并使后者發(fā)生自降解而喪失對(duì)多種caspase的抑制作用；同時(shí)去泛素化酶CYLD、USP7或USP2a通過介導(dǎo)RIPK1的去泛素化使其脫離TNFR1受體復(fù)合物，轉(zhuǎn)而在胞質(zhì)中招募含有死亡結(jié)構(gòu)域(DD)的接頭蛋白FADD及caspase-8，最終形成另一種死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)并介導(dǎo)凋亡[39,40]。相應(yīng)的研究表明，通過線性泛素鏈被招募到TNFR1復(fù)合物中的另一種去泛素化酶A20則能夠通過自身的ZnF與泛素分子相互作用來起到穩(wěn)定泛素鏈的作用[41]。RIPK1非依賴的凋亡信號(hào)通路則是由胞質(zhì)中一類通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FADD而抑制caspase-8活性的蛋白c-FLIP所決定，且受到了泛素系統(tǒng)的調(diào)控。c-FLIP包括c-FLIPL、c-FLIPS及c-FLIPR三種亞型，例如在Mtb引起的活性氧(ROS)依賴的巨噬細(xì)胞凋亡途徑中，涉及到ASK1、p38及c-Abl三類激酶的激活并引發(fā)c-FLIPS的酪氨酸/絲氨酸磷酸化，促進(jìn)后者與E3連接酶c-Cbl的結(jié)合及泛素化降解，從而解除對(duì)caspase-8的抑制作用[42]。

在感染初期，Mtb能夠通過抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)自身的胞內(nèi)存活，而感染晚期的Mtb卻通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來逃離衰竭的細(xì)胞并擴(kuò)散感染[43]。與凋亡所不同的是，細(xì)胞發(fā)生壞死時(shí)將出現(xiàn)質(zhì)膜破裂和內(nèi)容物的外溢，同時(shí)引起炎癥免疫反應(yīng)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)非caspase或細(xì)胞色素C介導(dǎo)的死亡實(shí)際上也受到了復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，并把這類細(xì)胞死亡方式歸入程序性細(xì)胞壞死(Necroptosis)的范疇。程序性壞死的調(diào)控核心是RIPK3及MLKL激酶。在TNFR1介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中，若caspase-8活性降低或胞質(zhì)中RIPK3和MLKL蛋白水平較高時(shí)，RIPK3將通過RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK1結(jié)合并自磷酸化，活化后的RIPK3通過招募特異性底物MLKL作為壞死執(zhí)行者激活壞死信號(hào)通路[44]。如前所述，泛素系統(tǒng)能夠通過對(duì)RIPK1的修飾起到對(duì)胞質(zhì)中caspase-8活化水平的調(diào)節(jié)，從而決定細(xì)胞凋亡或程序性壞死的發(fā)展方向。近年來還發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)調(diào)控p53和p21泛素化降解而起到凋亡調(diào)控作用的E3連接酶MKRN1也能通過泛素化FADD來抑制caspase-8的活性，同時(shí)影響壞死小體(Necrosome)的形成[45]。另一方面，RIPK3和MLKL本身也存在泛素化修飾的現(xiàn)象，例如鼠源RIPK3在K5位置能夠被A20泛素化從而促進(jìn)其與RIPK1形成復(fù)合物，然而MLKL的泛素化修飾機(jī)制目前尚不清楚[46]。

3 結(jié)核分枝桿菌利用泛素系統(tǒng)逃避免疫清除的機(jī)制

效應(yīng)蛋白是Mtb在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活并逃逸免疫清除的最大助力(圖1)。目前所發(fā)現(xiàn)的Mtb效應(yīng)蛋白的功能至少有6個(gè)方面：①促進(jìn)Mtb的侵染入胞，如Erp、FbpA、Mce3家族等細(xì)胞壁蛋白能夠被分泌到環(huán)境中幫助Mtb黏附和感染宿主[11,47]；②具有抗氧化/氮化應(yīng)激作用，如SodA、KatG、AhpC及TpX等酶類能夠抵抗胞內(nèi)的活性氧/氮介質(zhì)(ROI/RNI)對(duì)Mtb的脅迫[11,48]；③參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，近年來鑒定出MPT64、Rv3354及PtpA等多種效應(yīng)蛋白具有凋亡抑制功能，例如MPT64能夠增強(qiáng)宿主巨噬細(xì)胞Bcl-2蛋白家族的表達(dá)水平，而PtpA則能夠去磷酸化增強(qiáng)GSK3α的抗凋亡活性[49]；④抑制吞噬體的成熟，如Mtb分泌的一類核苷二磷酸激酶Ndk能夠抑制Rab5和Rab7與各自的效應(yīng)分子EEA1或RILP的結(jié)合[50]；又如PtpA及Mtb分泌的另一種磷酸酶SapM，前者能夠去磷酸化宿主的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VPS33B，同時(shí)結(jié)合溶酶體膜上的V-ATPase的H亞基來阻止吞噬體與吞噬體膜相融合[51]；后者則能去磷酸化吞噬體膜上的PI3P阻礙吞噬體發(fā)展[52]；⑤抑制炎癥信號(hào)通路的活化，例如，PknE能夠抑制人THP-1巨噬細(xì)胞的TNF-α和IL-6炎癥因子的分泌水平[11,53]；而Mtb分泌的金屬蛋白酶Zmp1則能夠抑制caspase-1的活性，進(jìn)而抑制pro-IL-1β的切割活化，并阻礙炎癥小體的形成[54]。最近發(fā)現(xiàn)Mtb膜效應(yīng)蛋白Mce3E在感染過程中會(huì)進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)靶向結(jié)合MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶Erk1/2，并滯留活化的Erk1/2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中而阻礙其入核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制TNF-α和IL-6的表達(dá)水平[55]；⑥抑制細(xì)胞自噬，例如Mtb效應(yīng)蛋白EIS能夠增強(qiáng)組蛋白H3的乙?；絹砩险{(diào)巨噬細(xì)胞的IL-10的基因表達(dá)水平，通過活化Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路來抑制細(xì)胞自噬[56]。最近還鑒定出分枝桿菌效應(yīng)蛋白PE_PGRS47也具有自噬抑制功能，該蛋白缺失的Mtb感染巨噬細(xì)胞將顯著增多胞質(zhì)中LC3的聚集，且p62自噬受體的降解明顯增強(qiáng)[57]。

利用泛素系統(tǒng)逃避宿主的免疫清除是近年來發(fā)現(xiàn)的一種Mtb的重要免疫逃逸機(jī)制，該機(jī)制有賴于Mtb效應(yīng)蛋白PtpA等的調(diào)控功能。研究發(fā)現(xiàn)：PtpA存在一個(gè)全新的類泛素結(jié)合模序UIML，能夠通過非共價(jià)結(jié)合到單泛素分子的疏水氨基酸簇上來增強(qiáng)自身磷酸酶活性，并靶向宿主MAPK信號(hào)通路中兩類關(guān)鍵激酶JNK和p38，或吞噬體成熟相關(guān)蛋白VPS33B起到去磷酸化抑制的作用；同時(shí)還可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TAB3的NZF鋅指結(jié)構(gòu)抑制后者與K63泛素化的結(jié)合進(jìn)而阻斷NF-κB信號(hào)通路，并降低TNF-α及IL-1β的表達(dá)水平[58]。近年來，還鑒定出Mtb的一類蛋白激酶Rv3354具有保護(hù)Mtb分泌蛋白不被宿主泛素化降解的功能。Rv3354能夠靶向結(jié)合宿主的一類蛋白質(zhì)降解調(diào)控復(fù)合物——COP9信號(hào)小體(CSN)的JAMM結(jié)構(gòu)域并抑制其對(duì)泛素樣蛋白Nedd8的切割活性，而Nedd8的切割是CNS調(diào)控宿主CRL家族E3連接酶復(fù)合物活化的關(guān)鍵[59]。此外，在Mtb感染過程中，諸多泛素相關(guān)基因出現(xiàn)了明顯的上調(diào)(如mkrn1、cops5等)或下調(diào)(zfp91、ndfip2、ube2f、rnft1、psmb6和psmd13等)現(xiàn)象，這暗示泛素系統(tǒng)在Mtb-宿主相互作用過程中具有極為重要的調(diào)控功能[60]。

圖1 結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)蛋白的免疫抑制功能Fig.1 Immunosuppressive functions of M.tuberculosis effector proteinsNote: Mtb effector proteins play a pivotal role in orchestrating host innate immune signaling pathway.Erp,FbpA and Mce3 are essential for maintaining Mtb virulence during the infection[11,47].The antioxidant enzymes SodA,KatG,AhpC and TpX confer Mtb resistance to host oxidative/nitrosative stresses[11,48].SapM,Ndk and PtpA arrest phagosome by targeting PI3P,Rab5/7 and V-ATPase,respectively[50-52].The Rab7 recruitment is also undermined by ESAT-6 and PhoP[64].PE_PGRS47 reduces LC3 puncta and p62 degradation,whereas EsxH and EsxG impair MVB formation to inhibit autophagy[57].PtpA competitively interacts with TAB3 to prevent the binding of K63 Ub chains and directly dephosphorylates phos-p38 and phos-JNK to inhibit both NF-κB and MAPK pathway[58].MPT64,Rv3354 and PtpA have different apoptotic regulatory functions when delivered into cytoplasm[49].ZMP1 acts as a Zn2+ metalloprotease with the ability to restrain the host inflammasome development and suppress the activity of caspase-1[54].

有趣的是，宿主并不甘于被動(dòng)地接受Mtb對(duì)泛素系統(tǒng)的挾持。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，宿主的一類E3連接酶Trim27能夠通過RING結(jié)構(gòu)域結(jié)合PtpA，對(duì)PtpA等Mtb效應(yīng)蛋白引起的巨噬細(xì)胞天然免疫抑制功能產(chǎn)生對(duì)抗作用，進(jìn)而限制分枝桿菌的胞內(nèi)存活，這類具有抵御病原菌作用的宿主蛋白被稱為限制因子(Restriction factors)[61]。事實(shí)上，宿主泛素系統(tǒng)威脅Mtb胞內(nèi)存活的另一張王牌是依賴泛素系統(tǒng)的選擇性自噬機(jī)制。除了Parkin介導(dǎo)的Mtb泛素化，最近還發(fā)現(xiàn)宿主范醌蛋白1(UBQLN1)也能夠通過Mtb的ESAT-6效應(yīng)蛋白EsxA與菌表面發(fā)生相互作用，進(jìn)而促進(jìn)泛素、p62及LC3在Mtb表面聚集并介導(dǎo)Parkin非依賴性的自噬降解[62]。此外，宿主對(duì)Mtb的選擇性自噬也可能通過TLR2活化的DNA損傷相關(guān)自噬調(diào)節(jié)子DRAM1介導(dǎo)而聚集LC3，該過程無需泛素及p62等受體的參與[32,63]。然而，巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中的Mtb強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37Ra雖然都能被自噬體捕獲，但前者明顯能夠抑制自噬體的進(jìn)一步成熟及與溶酶體融合。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb強(qiáng)毒株能夠通過阻止自噬體招募Rab7來抑制其與內(nèi)體形成中間囊泡(Amphisome)的成熟過程，而這種能力有賴于ESAT-6分泌系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)因子PhoP的協(xié)助[64]。此外，Mtb通過調(diào)控宿主miRNA影響自噬相關(guān)基因的表達(dá)是新近發(fā)現(xiàn)的一種免疫逃逸機(jī)制。Mtb感染過程中將誘導(dǎo)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞miR-33及其過客鏈(passenger strand)miR-33*的表達(dá)水平，而miR-33和miR-33*的上調(diào)表達(dá)將負(fù)向調(diào)控一系列自噬相關(guān)蛋白(如ATG5、ATG12、LC3B及LAMP1等)編碼基因的表達(dá)水平，改變宿主的自噬調(diào)控程序[65]。

4 展望

綜上所述，越來越多的研究表明：泛素系統(tǒng)的免疫調(diào)控功能對(duì)宿主抵御病原菌感染具有重要作用，但這一特點(diǎn)也能被病原菌所利用。目前已在沙門氏菌、李斯特菌、志賀菌、嗜肺軍團(tuán)菌、耶爾森氏菌(Yersinia)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)及腸致病性大腸桿菌(EPEC)等多種病原菌中鑒定出一系列具有真核細(xì)胞E3連接酶或DUBs活性的效應(yīng)蛋白，這些病原菌可通過模擬宿主泛素系統(tǒng)的功能進(jìn)而擾亂宿主防御機(jī)制并達(dá)到免疫逃逸的目的[66]。然而，有關(guān)這些病原菌效應(yīng)蛋白在病原-宿主互作過程中的調(diào)控機(jī)制方面的研究?jī)H是冰山一角，很多未知的問題有待進(jìn)一步探尋。例如，這些效應(yīng)蛋白在原核生物中是否普遍存在或具有同源性蛋白？在感染過程中它們究竟受到何種時(shí)間或空間依賴性的精細(xì)調(diào)控？其作用是否具有宿主和細(xì)胞特異性？宿主又有哪些限制因子用來規(guī)避或降解這些病原菌效應(yīng)蛋白？針對(duì)以上一系列問題，建立合適的病原-宿主感染模型，并應(yīng)用多學(xué)科交叉的手段從病原菌感染免疫、蛋白分子生化修飾、細(xì)胞信號(hào)通路級(jí)聯(lián)調(diào)控等角度深入研究病原菌效應(yīng)蛋白的調(diào)控功能和機(jī)制，將有望為感染性疾病的防控提供新策略以及為抗感染藥物研發(fā)提供新靶點(diǎn)。

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[收稿2016-11-18]

(編輯 倪 鵬)

Regulatory mechanisms of ubiquitin system in Mycobacterium tuberculosis-host interactions

CHAIQi-Yao,LIUCui-Hua.

CASKeyLaboratoryofPathogenicMicrobiologyandImmunology,InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is an extremely successful intracellular bacterial pathogen that engages multiple strategies to escape host immune surveillance,so as to survive within host macrophages for long period.Upon the invasion of pathogenic bacteria,the host ubiquitin system plays a critical role in activating the host innate immune responses and associated signaling pathways such as inflammatory and immune responses,autophagy,phagosome maturation and cell death,etc.On the other hand,recent studies have demonstrated that intracellular pathogenic bacteria such as Mtb can secrete a variety of effector proteins into host cells to hijack or co-opt the ubiquitin system to suppress host immune responses.Those pathogen-host interacting interfaces could provide potential novel targets for the development of anti-tuberculosis drugs.

Ubiquitin system;Mycobacterium tuberculosis;Macrophage;Innate immunity;Signaling pathway;Effector proteins

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.001

R392

A

1000-484X(2017)02-0161-09

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81371769, 81571954)、國(guó)家973基礎(chǔ)科學(xué)項(xiàng)目(2014CB744400)和中國(guó)科學(xué)院“青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)優(yōu)秀會(huì)員”項(xiàng)目(Y12A027BB2)資助。