胡海巖 王華民 林英姿 常彩紅 楊 文 王永霞

(海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，?？?71109)

紅樹(shù)林淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)小鼠DCs表型成熟的影響①

胡海巖 王華民②林英姿②常彩紅②楊 文②王永霞②

(海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，?？?71109)

目的：探討紅樹(shù)林來(lái)源的淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)表型成熟的影響。方法：從小鼠骨髓腔中分離獲得單核細(xì)胞，加入細(xì)胞因子rmGM-CSF、rmIL-4 誘導(dǎo)分化為未成熟DCs并用不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖干預(yù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成熟DCs的表面標(biāo)志CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86分子的表達(dá)及吞噬FITC-dextran 的能力，ELISA檢測(cè)該多糖對(duì)DCs分泌IL-12的影響；MTT法檢測(cè)該多糖對(duì)DCs刺激T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：經(jīng)400 μg/ml多糖作用48 h后DCs 表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86的表達(dá)顯著上調(diào)，與空白對(duì)照組相比P<0.01，與LPS組相比P>0.05；經(jīng)該多糖作用后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降，尤其300 μg/ml 、400 μg/ml的多糖作用效果最明顯，與空白對(duì)照組相比P<0.05；該多糖還可刺激DCs分泌IL-12，尤其100～400 μg/ml的多糖刺激作用較強(qiáng)，與空白對(duì)照組相比P<0.05；另外，經(jīng)該多糖處理的DCs還可刺激T細(xì)胞增殖，將不同比例刺激細(xì)胞與T作用后均可見(jiàn)T細(xì)胞增殖，與空白對(duì)照組相比P<0.05。結(jié)論：淡紫擬青霉胞外多糖可上調(diào)DCs表面 CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子表達(dá)，降低其吞噬能力，促進(jìn)其分泌IL-12，還可刺激T細(xì)胞增殖，初步表明該多糖可刺激DCs分化成熟。

胞外多糖;淡紫擬青霉；樹(shù)突狀細(xì)胞；表型；成熟

樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)作為功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，其最大特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始T細(xì)胞活化，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[1-3]，人和動(dòng)物體內(nèi)的DCs包括成熟和未成熟兩種狀態(tài)，未成熟DC由于高表達(dá)Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)等抗原識(shí)別受體[4]，攝取抗原的能力強(qiáng)，但活化T細(xì)胞的能力弱；病原體或其他刺激可活化DCs，使其分化成熟，成熟DCs攝取抗原能力減弱，但由于高表達(dá)MHCⅡ、CD86、CD80等分子，提呈抗原的能力及活化T細(xì)胞的能力增強(qiáng)[5,6]。因此，通過(guò)調(diào)控體內(nèi)DCs的成熟狀況，可改變機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防或治療疾病的目的。

課題組前期從海南紅樹(shù)林中分離鑒定出一株淡紫擬青霉，其產(chǎn)生的胞外多糖體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬功能及T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用[7]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上探討淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)以小鼠骨髓源性DCs成熟及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6～8周齡BALB/c小鼠，雄性，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑及藥物 淡紫擬青霉胞外多糖由本室獲得，用雙蒸水配成20 g/L母液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存。APC標(biāo)記的抗小鼠CD11c單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠MHCⅡ單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠CD80單克隆抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD86單克隆抗體及FITC-dextran購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司。RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，陽(yáng)性對(duì)照多糖為脂多糖，購(gòu)自Sigma公司，絲裂霉素C，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 流式細(xì)胞儀 FACScan(BD 公司)，生物安全柜(SG403A-HE，美國(guó))，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(NU-4750E，美國(guó))，倒置顯微鏡(深圳拓天儀器設(shè)備有限公司)，電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning,美國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來(lái)源DCs體外誘導(dǎo)及培養(yǎng) 取6～8周齡BALB/c雄性小鼠40只，SPF級(jí)，頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡10～15 min，無(wú)菌手術(shù)取出股骨和脛骨，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，離心，棄上清。紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞，PBS洗3遍后用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液(含10 ng/ml rmGM-CSF和10 ng/ml rmIL-4)調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/ml，以3 ml/孔加入6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，吸附3 h后去除未貼壁細(xì)胞，重新加入完全培養(yǎng)液，隔日半量換液，第6天收集未成熟DCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs表型的影響 收集未成熟DCs 用RPMI1640維持液配成1×106ml-1細(xì)胞懸液，接種12孔板，每孔2 ml。加入不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖，終濃度分別為50、100、200、300 μg/ml，每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，以RPMI1640為陰性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隔天換液并觀察細(xì)胞形態(tài)。收集細(xì)胞，洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，加入APC-CD11c、PE-MHCⅡ和PE-CD80、FITC-CD86，4℃染色標(biāo)記 30 min，洗滌3次，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs吞噬能力的影響 收集未成熟DCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml，加入終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞置37℃孵育30 min，加入FITC-dextran，終濃度為1 mg/ml，37℃孵育4 h，4℃作用1 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.2.4 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子的影響 無(wú)血清培養(yǎng)基將未成熟DCs 配成1×106ml-1細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，每孔1 ml。加入終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/ml多糖，每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以RPMI1640為陰性對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),隔天換液并觀察細(xì)胞形態(tài)，于72 h收集各組上清液，3 000 r/min 10 min去除顆粒和聚合物。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定上清液中IL-12水平。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs刺激T細(xì)胞增殖能力的影響

1.2.5.1 反應(yīng)性T細(xì)胞的制備 取6～8周齡BALB/c小鼠，脫臼處死，無(wú)菌操作取小鼠脾臟，研磨制備脾細(xì)胞懸液，用200目細(xì)胞篩過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液，離心，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液充分裂解紅細(xì)胞，加入無(wú)血清1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)，離心洗滌兩次。用含10%小牛血清的培養(yǎng)液(含IL-2 5 ng/ml)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107ml-1。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后收集未貼壁細(xì)胞作為T(mén)細(xì)胞備用。

1.2.5.2 刺激細(xì)胞的制備 將1×106ml-1未成熟DCs接種于24孔板中，每孔1 ml。加入終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖，每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，收集各組細(xì)胞為刺激細(xì)胞，加入終濃度為25 μg/ml 的絲裂霉素C，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，PBS洗2遍，1 500 r/min離心5 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。

1.2.5.3 DC與T淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng) 將制備好的刺激細(xì)胞加入96孔板，每孔100 μl，加入經(jīng)絲裂霉素C滅活的DCs，T細(xì)胞與DCs的比例分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，每孔終體積為200 μl，每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)單一T細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，吸棄上清。每孔加20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加150 μl DMSO震蕩10 min，等待結(jié)晶物全部溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處光密度值(OD)。T細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔OD-對(duì)照孔OD)/對(duì)照孔OD×100%。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓來(lái)源DCs體外誘導(dǎo)及培養(yǎng) 棄除懸浮細(xì)胞并更換含有細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)基后，可見(jiàn)貼壁細(xì)胞大小均勻，呈圓形。培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。培養(yǎng)第3天，可見(jiàn)疏松黏附與貼壁細(xì)胞的集落產(chǎn)生，細(xì)胞體積變大，形狀不規(guī)則。培養(yǎng)第5天，可見(jiàn)細(xì)胞集落增多，細(xì)胞多呈星狀、蝌蚪狀，有明顯突起。

圖1 倒置顯微鏡下不同時(shí)間DCs形態(tài)變化Fig.1 Morphologic feature of DCs was photographed in different phases

2.2 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs表型的影響 將不同濃度多糖作用于未成熟DCs 48 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面分子表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)不同濃度多糖均可刺激DCs CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子表達(dá)，且在所用濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。多糖終濃度為50、100、200 μg/ml時(shí)，CD11c、MHCⅡ雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(24.4±1.2)%、(27.1±2.0)%、(33.9±3.5)%，與空白對(duì)照組(23.5±0.16)%相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與LPS組(53.1±1.5)%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而當(dāng)多糖終濃度達(dá)300、400 μg/ml時(shí)CD11c、MHCⅡ雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(42.8±2.6)%、(50.4±1.3)%，與空白對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與LPS組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同濃度多糖亦可促進(jìn)DCs CD80和CD86共刺激分子的表達(dá)，多糖終濃度為50、100、200、300、400 μg/ml時(shí)CD80、CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(29.8±3.1)%、(32.1±1.7)%、(40.3±1.5%)、(50.7±2.4)%、(61.0±0.5)%，其中多糖終濃度300、400 μg/ml 作用下的DCs雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率與空白對(duì)照組(27.9±1.2)%相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，400 μg/ml多糖作用下的DCs雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率與LPS組(70.2±2.5)%相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明多糖終濃度在400 μg/ml時(shí)對(duì)DCs分化成熟的刺激作用最好，部分流式結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs 表達(dá)CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子的影響Fig.2 Expression level of CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD86 on DCs treated by polysaccharides

圖3 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs吞噬能力的影響流式圖Fig.3 Influence of polysaccharides on DCs phagocytotic ability by flow cytometry

圖4 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs吞噬能力的影響±s)Fig.4 Effect of polysaccharides on phagocytosis of Note: Compared with blank control group，*.P<0.05.

圖5 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)IL-12分泌的影響±s)Fig.5 Effects of IL-2 production in culture supernatants treated with different concentration ±s)Note: Compared with blank control group，*.P<0.05;△.P<0.01.

GroupsODvalueDCs∶T=1∶40DCs∶T=1∶20DCs∶T=1∶10DCs∶T=1∶5DCstreatedwith50μg/mlpolysaccharides0429±00141)0476±00142)0510±00022)0522±00022)DCstreatedwith100μg/mlpolysaccharides0438±00041)0524±00082)0547±00052)0563±00042)DCstreatedwith200μg/mlpolysaccharides0465±00082)0544±00102)0606±00062)0625±00052)DCstreatedwith300μg/mlpolysaccharides0470±00022)0592±00052)0623±00022)0656±00042)DCstreatedwith400μg/mlpolysaccharides0507±00052)0632±00162)0658±00032)0725±00102)Blankcontrol0407±00070440±00210467±00050464±0005

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;2)P<0.01.

2.3 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs吞噬能力的影響 未成熟DC經(jīng)過(guò)不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖處理48 h后，吞噬FITC-dextran的能力逐漸降低，呈劑量依賴性，部分流式結(jié)果見(jiàn)圖3，50、100和200 μg/ml多糖濃度時(shí)陽(yáng)性吞噬細(xì)胞百分率分別為(30.5±1.9)%、(28.6±1.4)%和(25.0±1.5)%，與空白對(duì)照組(35.8±1.1)%相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)糖濃度達(dá)300 μg/ml及400 μg/ml時(shí)陽(yáng)性吞噬細(xì)胞百分率分別為(20.0±2.0)%、(18.1±1.7)%，與空白對(duì)照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明300 μg/ml和400 μg/ml的多糖對(duì)DCs成熟的刺激作用較強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子的影響 將不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖作用于DCs 72 h后，收集上清液，ELISA法檢測(cè)IL-12分泌水平，結(jié)果如圖5，不同濃度該多糖對(duì)DCs分泌IL-12的刺激能力不同，刺激作用呈劑量依賴性，50 μg/ml濃度多糖作用下DCs分泌IL-12的量最少，為(44.2±3.6)pg/ml，與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，多糖為100 μg/ml時(shí)IL-12的分泌量為(49.3±2.1)pg/ml，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨多糖濃度增加DCs分泌IL-12的量亦逐漸升高，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

2.5 淡紫擬青霉胞外多糖對(duì)DCs刺激T細(xì)胞增殖能力的影響 將不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖處理的DCs作為刺激細(xì)胞刺激T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同比例的刺激細(xì)胞與T細(xì)胞混合孵育后均可見(jiàn)T細(xì)胞增殖，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)50 μg/ml和100 μg/ml多糖處理的DCs與T細(xì)胞比例為1∶40時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余組與空白對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)，說(shuō)明多糖處理過(guò)的DCs具有一定的刺激T細(xì)胞增殖能力，見(jiàn)表1。

3 討論

多糖類化合物具有良好的生物活性，早在1943年便開(kāi)始作為藥物使用。紅樹(shù)林真菌是生活在紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)中的第二大微生物資源[8]，長(zhǎng)期生活在寡營(yíng)養(yǎng)、弱堿性的含鹽海洋環(huán)境中，形成了獨(dú)特的耐饑、耐堿和耐鹽等生存機(jī)制，可產(chǎn)生出完全不同于陸生真菌的多糖類生物活性物質(zhì)[9,10]。研究表明，紅樹(shù)林真菌胞外多糖主要為雜多糖，具有良好的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[11,12]。

本研究用不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖處理小鼠骨髓源性未成熟DCs，觀察其對(duì)DCs功能成熟的影響，發(fā)現(xiàn)在所用多糖濃度范圍內(nèi)均可刺激未成熟DCs 向成熟狀態(tài)分化，可促進(jìn)DCs 表面CD11c 、MHCⅡ、CD80和CD86分子表達(dá)，尤其終濃度為400 μg/ml 的多糖刺激作用較強(qiáng)，CD11c、MHCⅡ雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD80、CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率與空白對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與LPS組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CD11c 為DCs特征性標(biāo)志，MHCⅡ參與對(duì)T細(xì)胞抗原肽的提呈并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的發(fā)生，CD80、CD86為協(xié)同刺激分子，可為T(mén) 細(xì)胞的活化提供第二信號(hào)，DCs成熟時(shí)顯著上調(diào)MHCⅡ、CD80、CD86分子的表達(dá)，說(shuō)明400 μg/ml多糖對(duì)DCs分化成熟的刺激作用較強(qiáng)，與LPS作用相似。經(jīng)該多糖刺激的DCs吞噬FITC-dextran的能力亦逐漸降低，尤其經(jīng)300、400 μg/ml多糖處理的DCs吞噬率與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明300、400 μg/ml的多糖可顯著促進(jìn)DCs成熟。該多糖還對(duì)DCs分泌IL-12具有一定刺激作用，100～400 μg/ml的多糖刺激作用較強(qiáng)，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-12為促使Th0向Th1分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著重要作用。另外，該多糖處理的DCs還具有刺激T細(xì)胞增殖的作用，將不同濃度多糖處理的DCs刺激T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同比例的DCs與T細(xì)胞混合孵育后均見(jiàn)T細(xì)胞增殖，增殖率與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明多糖處理過(guò)的DCs具有一定的刺激T細(xì)胞增殖的能力。

總之，紅樹(shù)林來(lái)源的淡紫擬青霉胞外多糖可在一定程度上刺激小鼠骨髓源性DCs分化成熟，具有表現(xiàn)在可刺激DCs 表面CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86等分子的表達(dá)，下調(diào)其吞噬作用，促進(jìn)IL-12分泌，刺激T細(xì)胞增殖，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

[1] Banchereau J,Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity[J].Nature,1998,392(19): 245-252.

[2] Nicoletti C,Regoli M,Bertelli E.Dendritic cells in the gut: to sample and to exclude?[J].Mucos Immunol,2009,2(5): 462-463.

[3] Klechevsky E,Kato H,Sponaas AM.Dendritic cells star in Vancouver[J].J Exp Med,2005,202: 5-10.

[4] Yoon YD,Han SB,Kang JS,etal.Toll-like receptor 4-dependent activation of macrophages by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiorum[J].Int Immuno-pharmacol,2003,3(13/14): 1873-1882.

[5] Sandor F,Buc M.Toll-like receptors.Structure,function and their ligands[J].Folia Biol(Praha),2005,51(5):148-157.

[6] Gianotti L,Sargenti M,Galbiati F,etal.Phenotype and function of dendritic cells and T-lymphocyte polarization in the human colonic mucosa and adenocarcinoma[J].Eur J Surg，Oncol,2008,34(8):883-889.

[7] 饒朗毓，陳政良，裴 華，等.一株具免疫增強(qiáng)活性紅樹(shù)林真菌的篩選及鑒定[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2011,11(6):683-685.

[8] Chen YL,Mao WJ,Tao HW,etal.Preparation and characterization of a novel extracellular polysaccharide with antioxidant activity,from the mangrove-associated fungus fusarium oxysporum[J].Marine Biotechnol,2015,17(2):219-228.

[9] Chi ZM,Fang Y.Exopolysaccharides from marine bacteria[J].J Ocean Uni China,2005,4(1):67-74.

[10] Al-Sayed HA,Ghanem EH,Saleh KM.Bacterial community and some physico-chemical characteristics in a subtropical mangrove environment in Bahrain[J].Marine Pollution Bulletin,2005,50:147-155.

[11] Kumaran S,Ramaprasanna D,Murugaiyan K.Production and characterization of exopoly- saccharides (EPS) from mangrove filamentous fungus,Syncephalastrum sp[J].African J Microbiol Res,2014,8(21):2155-2161.

[12] Yan M,Mao W,Chen C,etal.Structural elucidation of the exopolysaccharide produced by the mangrove fungus Penicillium solitum[J].Carbohydrate Polymers,2014,111C(1):485-491.

[收稿2016-08-12]

(編輯 張曉舟)

Effects of extracellular polysaccharides from Paecilomyces Lilacinuson on function of mouse bone marrow-derived dendritic cells

HUHai-Yan，WANGHua-Min,LINYing-Zi，CHANGCai-Hong,YANGWen,WANGYong-Xia.

ClinicalMedicalCollege，HainanMedicalUniversity，Haikou571109，China

Objective:To investigate the effects of the Paecilomyces Lilacinuson extracellular polysaccharides on the phenotypic and maturation of murine dendritic cells.Methods: Imature DCs were induced in vitro from the murine bone marrow cells in the presence of rmGM-CSF and rmIL-4,and then they were cultured with different dosage of the extracellular polysaccharides.The morphological characterization was analyzed under microscopy.The expressions of the DCs surface costimulating factors and phagocytic function to FITC-dextran were detected by flow cytometry.The level of IL-12 secreted by DCs was observed by ELISA.At the same time the influence of DCs on the proliferation of T cells was determined by MTT.Results: Treating with the polysaccharides for 48 h could up-regulate the expression of DCs surface molecules,such as CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD86,and the 400 μg/ml was the optimal dose，comparing with the blank control group, the difference was significant (P<0.01), contrast to LPS control group that was not different (P<0.05).The uptaking FITC-dextran ability of the DCs treated with 300 μg/ml and 400 μg/ml polysaccharides was significant lower than the unstimulated DCs(P<0.05).At the same time the extract at different concentration could distinctly enhance the proliferation of T cells by DCs too.Conclusion: The extracellular polysaccharides could stimulate the maturation of dendritic cells and induce the production of mature dendritic cells.

Extracellular polysaccharides;Paecilomyces Lilacinuson;Dendritic cells;Phenotype;Maturation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.010

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260225)、海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(813248)和科研培育基金項(xiàng)目(HY2014-05)。

胡海巖(1979年-)，男，講師，主要從事感染免疫及免疫調(diào)節(jié)研究，E-mail:34171599@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：王永霞(1971年-)，女，碩士，副教授，主要從事感染與免疫研究，E-mail: 492608405@qq.com。

R392.9

A

1000-484X(2017)02-0212-05

②海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院，?？?71109。